2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26220603
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
谷口 正輝 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (40362628)
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| Project Period (FY) |
2014-05-30 – 2019-03-31
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| Keywords | １分子シークエンシング / ペプチド / １分子科学 / トンネル電流 / ナノギャップ電極 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究開始当初、ナノギャップ電極を作る機械的破断接合(MCBJ)の機械的安定性が十分ではないため、一定のナノギャップを長時間保持することが困難であり、シリコン基板上の固定ナノギャップ電極の開発を計画していた。しかし、MCBJの破断・接合の制御アルゴリズムとMCBJチップの絶縁膜材料を再検討したところ、溶液中におけるナノギャップ保持時間が25分以上の安定性が得られた。このMCBJの改良により、高い信頼性・再現性の電流―時間プロファイルを計測できるようになった。そこで、π電子系アミノ酸分子、σ電子系アミノ酸分子、およびリン酸化チロシンの1分子電気伝導度を決定するため、MCBJを用いて作製した0.5nmと0.7nmのナノギャップ電極により、1種類のアミノ酸分子のみが溶解した水溶液の電流―時間プロファイルを計測した。いずれのナノギャップ電極でも全てのアミノ酸分子で電気シグナルが得られたが、電流ヒストグラムに1つのピーク電流が得られたのは、0.5nmで9種類、0.7nmで9種類であり、全部で13種類のアミノ酸が1つのピーク電流を示した。チロシンとリン酸化チロシンは、0.7nmのナノギャップ電極で識別され、チロシンの1分子電気伝導度が大きいことが分かった。
さらに、成長因子であるペプチドとリン酸化チロシンを持つ修飾ペプチドの電流―時間プロファイルを0.7nmのナノギャップ電極で計測した。得られた電流―時間プロファイルを、アミノ酸の1分子電気伝導度を用いて解析したところ、アミノ酸の部分配列を決定することができ、修飾・非修飾ペプチドの識別に成功した。また、修飾・非修飾ペプチドの混合溶液の電流―時間プロファイルを計測し、チロシンとリン酸化チロシンのシグナル強度を比較することで、エラー率は大きいものの混合比を求めることができ、定量解析の可能性を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
研究初年度は、全アミノ酸20種類とリン酸化チロシンを含む計21種類の1分子電気伝導度を明らかにすることを目的としていたが、2種類の距離の異なる安定なナノギャップ電極を用いることで、リン酸化チロシンを含む全13種類のアミノ酸を1分子電気伝導度で識別できることを早い段階で実証できた。これは、研究当初課題であった、ナノギャップ電極を作る機械的破断接合(MCBJ)の弱い機械的安定を、破断・接合アルゴリズムとMCBJチップの絶縁材料の改良により解決できたからである。この安定なナノギャップ電極と13種類のアミノ酸の1分子電気伝導度を用いて、2年次に計画していた短いペプチドのアミノ酸配列決定と、3年次に計画していたペプチド上のリン酸化チロシンの1分子識別の実験を前倒しで行い、初年度にこれらに成功した。特に、成長因子として知られている10個のアミノ酸からなるペプチドの部分配列決定とリン酸化チロシンの識別に成功したことは大きな進展であった。また、これまでの1分子シークエンシング法を用いたDNAの塩基配列決定で開発してきた配列決定アルゴリズムをペプチドのアミノ酸配列決定に拡張できたことは、デバイス→計測→解析をつなぐパイプラインの確立へとつながり、DNA、RNA、ペプチド、および修飾塩基・アミノ酸を包括的に解析する1分子シークエンシング法のアウトラインの構築へとつながった。さらに、当初、計画していなかった修飾・非修飾ペプチドの水溶液中における混合比を、特定のアミノ酸の検出頻度を解析することで算出することができ、アミノ酸の配列決定と同時に混合比を求める定量解析の可能性を見出せたのは、予想以上の進展であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度における、ナノギャップ電極を作る機械的破断接合(MCBJ)の機械的安定性の大幅な改善により、研究計画当初、2年次、3年次に計画していたペプチドのアミノ酸配列決定とペプチド上のリン酸化チロシンの1分子識別に成功した。また、修飾・非修飾アミノ酸のアミノ酸配列と溶液中における混合比を同時に求めることができる定量解析の可能性を見出し、1分子シークエンシング法を大きく進展させることができた。そこで、ペプチドシークエンシング法で開発したパイプラインを用いて、4年次に計画していたDNAの修飾塩基分子の1分子マッピングと、修飾・非修飾DNAの混合溶液における塩基配列決定と定量解析を行う。また、1分子シークエンシグ法の重要なパラメータであるサンプルの検出限界濃度を明らかにする。さらに、5年次に計画していた修飾RNAの塩基配列決定と修飾塩基分子の1分子マッピングの実現に向けて、がんマーカーとして知られるマイクロRNAの混合溶液を測定対象として、塩基配列決定と定量解析を行う。このように、2年次は、本研究課題で目的とする全ての概念実証に挑戦し、1分子シークエンシング法が、修飾・非修飾のDNA・RNA・ペプチドの全てに適応できることを示すことに注力する。その後、1分子シークエンシング法において重要なパラメータとなる配列読取精度や配列読取速度を制御する技術開発を行うとともに、1分子シークエンシング法の原理を確立するため、読取精度の塩基・アミノ酸配列依存性を詳細に検討する。
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