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2017 Fiscal Year Annual Research Report

Single-Molecule Sequencing Methods via Tunneling Current

Research Project

Project/Area Number 26220603
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

谷口 正輝  大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (40362628)

Project Period (FY) 2014-05-30 – 2019-03-31
Keywords1分子シークエンシング / ペプチド / 1分子科学 / トンネル電流 / ナノギャップ電極
Outline of Annual Research Achievements

昨年度、1塩基分子のトンネル電流―時間波形を、機械学習を用いて解析することで、極めて高い1分子識別精度が得られることを見出した。この実験では、1塩基分子のみが溶解した水溶液を用いて測定を行い、波形を特徴量ベクトルで識別する方法を用いた。DNAとRNAの1本鎖では、パイ電子系である塩基分子が、電気伝導性が極めて低い糖とリン酸基で区切られているが、塩基分子の面間距離が近くなると、再隣接の塩基分子との電子的な相互作用がトンネル電流に影響すると予測される。本年度は、塩基分子間の電子的な相互作用を調べるため、2塩基分子からなる16種類のオリゴマーのトンネル電流―時間波形を計測し、機械学習を用いてオリゴマー内の2塩基分子の識別を行った。全てのオリゴマーが高い精度で識別され、オリゴマーを構成する塩基分子の1分子電気伝導度が、1塩基分子の1分子電気伝導度と同じであることを明らかにした。オリゴマーの電子状態を量子化学計算により検討したところ、オリゴマーのフロンティア軌道付近の分子軌道がどちらかの1塩基分子に局在し、異種塩基分子間のフロンティア軌道間の相互作用は極めて小さいことが分かった。この結果は、4つの塩基分子と電極との相互作用の大きさが同程度であると仮定すると、オリゴマーにおける塩基分子の1分子電気伝導度が、1塩基分子の1分子電気伝導度と同じである実験結果を支持している。また、1つのオリゴマー内において、リン酸基で終端される5’末端と糖で終端される3’末端の識別可能性が示唆された。
さらに、21塩基から構成される1本鎖DNAと、2つのチミンがトリフルリジンで置換された1本鎖DNAのトンネル電流―時間波形を計測し、部分塩基配列をアセンブルすることで全塩基配列決定を行った。1本鎖DNA中のチミンとトリフルリジンが、明確に識別さされることを明らかにした。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

DNAとRNA上における隣接塩基分子間相互作用の解明は、1分子シークエンシング法の学理を確立する上で必須であり、塩基配列決定の精度向上を行う上でも極めて重要となる。本年度実施したオリゴマーのトンネル電流―時間計測と機械学習による解析、およびオリゴマーの量子化学計算から、オリゴマー内では、異種塩基分子間の相互作用は極めて弱いことを見出すことができ、1分子シークエンシング法の学理構築が大きく前進した。DNAとRNAの末端部分は、-1価の電荷を持つリン酸基で終端される5’末端と、中性の糖で終端される3’末端の2つが存在する。両末端の物理化学的な主たる違いは電荷の有無であり、両末端の識別は―1価の電荷の識別を意味する。一方、DNAポリメラーゼが5′末端から3’末端の方向に働き、3’末端の方向にDNAとRNAが伸長するため、両末端の識別は、生物的にも極めて重要である。トンネル電流―時間波形の機械学習解析により、1塩基分子の高精度識別を実現し、1分子シークエンシング法の最大の課題を克服できたが、物理化学的にも生物的にも重要な両末端の識別は、機械学習を用いても極めて困難であると予測していた。しかし、塩基分子間相互作用の1分子電気伝導度への影響を調べるために行ったオリゴマーのトンネル電流―時間波形の研究において、5’末端と3’末端の識別の可能性を発見したのは想定外の結果であった。両末端の物理化学的な大きな違いは電荷であり、わずか―1価の電荷を識別できることを実証することは、1分子シークエンシング法が、DNAとRNAの塩基配列決定やペプチドのアミノ酸配配列決定のみならず、電荷の異なる1分子を識別する方法への展開が期待される。

Strategy for Future Research Activity

2塩基分子からなるオリゴマーの電流―時間波形の機械学習による解析から、1分子内の3’端と5’末端の識別の可能性が見えてきた。電流―時間波形の情報量を増加させて、機械学習による両末端の高精度識別を実現するため、電流計測の時間分解能を10KHzから100KHzまで向上させた計測システムを開発する。一般的に、機械学習の特徴量の物理・化学的な解釈は極めて困難であるが、オリゴマーの量子化学計算とそれに基づく1分子電気伝導度シミュレーションから、高い精度を与える特徴量の物理・化学的な解釈を試み、識別要因の解明に取り組む。
初年度、20種類のアミノ酸の内、12種類のアミノ酸、1種類の修飾アミノ酸の1分子識別、および10残基からなるペプチドの部分アミノ酸配列決定に成功した。この実験では、識別が困難であった8種類のアミノ酸でも、電流―時間波形が得られていたが、計測システムのノイズが大きく、機械学習による解析が行われていなかった。最終年度は、これまで開発してきた低ノイズ計測システムと機械学習による解析を用いて、20種類のアミノ酸の電流―時間波形を計測し、全種類のアミノ酸の高精度な1分子識別を行う。高い識別精度が得られない場合には、本年度開発する高時間分解能電流計測システムを用いて計測を行い、高精度な1分子識別を実現する。また、電流―時間波形の出現頻度とアミノ酸の等電点の相関性の発見を基に、pHを変えてアミノ酸の高精度な1分子識別を行い、これまで得られた知識の深化を図る。塩基分子と同様に、量子化学計算と1分子電気伝導度シミュレーションを用いて、高い精度を与える特徴量の物理・化学的な解釈に取り組む。さらに、10残基からなるペプチドの全アミノ酸配列決定を実現し、1分子ペプチドシークエンシング法を完成させる。

  • Research Products

    (26 results)

All 2018 2017 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (7 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 4 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 6 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results) Funded Workshop (1 results)

  • [Int'l Joint Research] University of California, San Diego(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      University of California, San Diego
  • [Int'l Joint Research] Single-Molecule Science and Technology(中国)

    • Country Name
      CHINA
    • Counterpart Institution
      Single-Molecule Science and Technology
  • [Journal Article] Electrical Nucleotide Sensor Based on Synthetic Guanine‐Receptor‐Modified Electrodes2018

    • Author(s)
      Takahito Ohshiro、Rajiv Kumar Verma、Kazumichi Yokota、Makusu Tsutsui、Sanjukta Mukherjee、Tomoji Kawai、Kazuhiko Nakatani、Masateru Taniguchi
    • Journal Title

      Chemistry Select

      Volume: 3 Pages: 3819~3824

    • DOI

      10.1002/slct.201702341

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Fast and Low-Noise Tunnelling Current Measurements for Single-Molecule Detections in Electrolyte Solution Using Insulator-Protected Nanoelectrodes2017

    • Author(s)
      Takanori Morikawa、Kazumichi Yokota、Makusu Tsutsui、Masateru Taniguchi
    • Journal Title

      Nanoscale

      Volume: 9 Pages: 4076~4081

    • DOI

      10.1039/C6NR09278K

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Short channel effects on electrokinetic energy conversion in solid-state nanopores2017

    • Author(s)
      Zhang Yan、He Yuhui、Tsutsui Makusu、Miao Xiang Shui、Taniguchi Masateru
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 7 Pages: 46661(1~14)

    • DOI

      10.1038/srep46661

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Detecting Single-Nucleotides by Tunneling Current Measurements at Sub-MHz Temporal Resolution2017

    • Author(s)
      Morikawa Takanori、Yokota Kazumichi、Tanimoto Sachie、Tsutsui Makusu、Taniguchi Masateru
    • Journal Title

      Sensors

      Volume: 17 Pages: 885(1~9)

    • DOI

      10.3390/s17040885

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Electrokinetic Analysis of Energy Harvest from Natural Salt Gradients in Nanochannels2017

    • Author(s)
      He Yuhui、Huang Zhuo、Chen Bowei、Tsutsui Makusu、Shui Miao Xiang、Taniguchi Masateru
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 7 Pages: 13156(1~15)

    • DOI

      10.1038/s41598-017-13336-w

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] The impact of membrane surface charges on the ion transport in MoS2 nanopore power generators2017

    • Author(s)
      Huang Zhuo、Zhang Yan、Hayashida Tomoki、Ji Ziwei、He Yuhui、Tsutsui Makusu、Miao Xiang Shui、Taniguchi Masateru
    • Journal Title

      Applied Physics Letters

      Volume: 111 Pages: 263104(1~4)

    • DOI

      10.1063/1.5003695

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Single-Molecule Analysis Methods Using Nanogap Electrodes and Their Application to DNA Sequencing Technologies2017

    • Author(s)
      Taniguchi Masateru
    • Journal Title

      Bulletin of The Chemical Society of Japan

      Volume: 90 Pages: 1189~1210

    • DOI

      10.1246/bcsj.20170224

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 極微電流計測が拓くバイオデバイス2018

    • Author(s)
      谷口正輝
    • Organizer
      第4回プリンテッドエレクトロニクス研究会
    • Invited
  • [Presentation] 機械学習と1分子解析技術の融合2018

    • Author(s)
      谷口正輝、鷲尾隆、川合知二
    • Organizer
      第65回応用物理学会春季学術講演会
    • Invited
  • [Presentation] 械学習と1分子シークエンシング法の融合2018

    • Author(s)
      谷口正輝
    • Organizer
      日本化学会第97春季年会
    • Invited
  • [Presentation] 核酸塩基プローブをもちいた核酸塩基鎖識別法の開発2018

    • Author(s)
      大城敬人
    • Organizer
      第65回応用物理学会春季学術講演会
  • [Presentation] DNAシーケンシングに向けた核酸塩基種別のための単分子高精度解析法の開発2018

    • Author(s)
      大城敬人
    • Organizer
      日本化学会第97春季年会
  • [Presentation] Development of Single-Molecule Electrophoretic Control Method for Single-Molecule Tunnel-Current based Nucleotide Identification by Nano-fluid integrated Nano-gap Devices2018

    • Author(s)
      Takahito Ohshiro
    • Organizer
      APS Spring 2018
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Single-Molecule Sequencing Technology2017

    • Author(s)
      Masateru Taniguchi
    • Organizer
      International Workshop on Life Detection Technology: For Mars, Enceladus and Beyond
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Single-Molecule Electrical Sequencing2017

    • Author(s)
      Masateru Taniguchi
    • Organizer
      Japanese-German Workshop, Single-Molecule Science and Technology
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ナノポア集積デバイスによる分離・検出法の創成に向けて2017

    • Author(s)
      大城敬人
    • Organizer
      第77回分析化学討論会
    • Invited
  • [Presentation] 機械学習を用いた1修飾塩基分子識別2017

    • Author(s)
      大城敬人
    • Organizer
      第77回応用物理学会秋季学術講演会
  • [Presentation] 機械学習を用いた1塩基識別2017

    • Author(s)
      谷口正輝
    • Organizer
      第77回応用物理学会秋季学術講演会
  • [Presentation] 人工核酸塩基識別のためのトンネル電流計測法の開発2017

    • Author(s)
      大城敬人
    • Organizer
      日本分析学会第66回年会
  • [Presentation] Development of Single-Molecule Detection and Translocation Control by Electrophoresis of Nano-fluid Toward Biopolymer Sequencing2017

    • Author(s)
      Takahito Ohshiro
    • Organizer
      MicroTAS 2017
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks] 谷口研究室ホームページ

    • URL

      http://www.bionano.sanken.osaka-u.ac.jp/

  • [Patent(Industrial Property Rights)] 基板2017

    • Inventor(s)
      谷口正輝、大城敬人、真田雅和、宮城聡
    • Industrial Property Rights Holder
      谷口正輝、大城敬人、真田雅和、宮城聡
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願:2017-212321
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 絶縁材上の金属線切断法2017

    • Inventor(s)
      谷口正輝、大城敬人、真田雅和、宮城聡
    • Industrial Property Rights Holder
      谷口正輝、大城敬人、真田雅和、宮城聡
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願:2017-212322
  • [Funded Workshop] Japanese-German Workshop, Single-Molecule Science and Technology2017

URL: 

Published: 2018-12-17   Modified: 2022-04-28  

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