2016 Fiscal Year Annual Research Report
Methods for the analysis and control of biomolecules in living cells based on molecular imaging
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26220805
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 博之 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (40221650)
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| Project Period (FY) |
2014-05-30 – 2019-03-31
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| Keywords | バイオ分析 / イメージング / スクリーニング / RNA / GPCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
テロメアRNAと相互作用するタンパク質を蛍光ラベルし，テロメアRNAと相互作用するタンパク質との1分子同時観察系を構築した．開発した顕微システムを用いて，テロメアRNAならびにテロメア結合タンパク質を同時観察し，統計的な解析を行った．結果，テロメアRNAの近傍でテロメア結合タンパク質が一定時間ストールする現象を見出した．また独自の1分子観察技術を用いて，ミトコンドリア膜上の凝集体VDACタンパク質を計測する技術を開発した．ミトコンドリア上のVDACタンパク質を計測するための細胞を樹立し，VDACの超解像イメージングを可能にした．
細胞膜リン脂質からアラキドン酸形成に重要なタンパク質であるcPLA2の光操作技術を開発した．cPLA2の細胞膜上への移行を外部光により制御することにより，アラキドン酸代謝産物が増加することを立証した．また，アラキドン酸形成に伴う細胞内シグナルAktが活性化していることから，cPLA2の光操作ツールが機能的に動作していることを確証した．
化合物ライブラリーから選抜したFPR1の阻害剤候補化合物のキャラクタリゼーションを行った． FPR1の活性化をGタンパク質のFRETにより評価し，化合物の阻害能を定量的に考察した．同様にβアレスチンシグナルの阻害能について評価を行った．また，βアレスチンのみのシグナルを光により時空間的に活性化させる技術を開発した．外部光刺激により，βアレスチンと結合したGPCRが細胞内にエンドサイトーシスすることを立証した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた神経軸索伸長の光制御するPA-DCCシステムの構築が早期に成功して論文に纏める段階にある．また，テロメアRNAのイメージング技術を早期に確立しその応用研究において，興味深い新たな知見を見出している．光操作技術については計画以上の進展があり，新たな光操作ターゲットを設定して様々な応用研究に波及している．
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| Strategy for Future Research Activity |
課題１では，テロメアRNAならびにテロメア結合タンパク質との1分子同時イメージングを行い，更にデータを収集・蓄積する．前年度に見出したテロメア結合タンパク質のダイナミクスに関する新たな知見を統計的に立証する．
ミトコンドリア膜上タンパク質の分子計測では，これまでBakの凝集体計測は固定した細胞で行っていたが，VDAC凝集体観察では生細胞による観察系を構築し，VDACの凝集過程を時空間的に追跡可能にする．
課題２では，Akt光操作技術を用いた1細胞解析への応用を展開する．Aktが働く重要な組織の一つである筋肉と脂肪細胞に着目し，Aktの時間活性とインスリン刺激との比較を，遺伝子発現（トランスクリプトーム）および代謝産物（メタボローム）の解析により行う．両者の比較から，Aktの細胞内シグナル特異性ならびにシグナルのクロストークについて新たな情報を取得する．また，Akt等の開発した光操作技術をマウス個体内で効率良く動作させることを目的として，新たにアップコンバージョン粒子を用いた光操作の基礎検討を行う．
課題３では，化合物ライブラリーから選抜したFPR1の阻害剤候補化合物のキャラクタリゼーションを目的として，FPR1とGタンパク質の1分子同時観察系を構築する．阻害剤がFPR1のオリゴマー形成を阻害するか，またFPR1とGタンパク質との相互作用にどのような阻害効果を有するか，1分子レベルで評価可能な新たな技術を開発する．また，前年度に開発したβアレスチンのみのシグナルを光により時空間的に活性化させる技術を用いて，βアレスチンとGPCRとの相互作用時間を様々変えて，GPCRの細胞内局在ならびに翻訳後修飾について詳細に調査する．GPCRとβアレスチンとの相互作用時間が，細胞内リサイクリングにどのような影響があるかを定量的に考察する．
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[Journal Article] Label-free versus conventional cellular assays: functional investigations on the human histamine H1 receptor2016
Author(s)
S. Lieb, T. Littmann, N. Plank, J. Felixberger, M. Tanaka, T. Schafer, S. Krief, S. Elz, K. Friedland, G. Bernhardt, J. Wegener, T. Ozawa and A. Buschauer,
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Journal Title
Pharmacol. Res.
Volume: 114
Pages: 13-26
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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