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2016 Fiscal Year Annual Research Report

Regulation of DNA repair pathway choice and gene editing by DNA repair machinery

Research Project

Project/Area Number 26241014
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

中田 慎一郎  大阪大学, 医学系研究科, 特命教授 (70548528)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 逆井 良  金沢医科大学, 医学部, 助教 (10549950)
寺尾 由里  大阪大学, 医学部, 技術職員 (80466846)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2018-03-31
KeywordsDNA修復 / ユビキチン / ゲノム編集
Outline of Annual Research Achievements

Cas9を用いて標的遺伝子にDNA2本鎖切断(DSB)をいれ、細胞外から導入したDNA修復鋳型を用いたDNA修復を誘導することで、ゲノム編集を行うことが可能である。しかし、DSBの修復では、ヌクレオチド欠失や挿入(indel)を伴う非相同末端結合(NHEJ)による修復が優位に起こるため、意図通りのゲノム編集を行うことが難しい。本研究では、Cas9の変異体D10Aを用いて、標的遺伝子の1つのDNA鎖に2カ所のニックを入れるタンデムニック法および標的遺伝子とドナープラスミドのそれぞれに1カ所ずつのニックを入れるSNGD法により、indel発生が強く抑制され、かつ効率の良いゲノム編集が可能であることを示した。これらの方法によるゲノム編集では、長いDNA長のドナーを用いることが有利であることも示した。鋳型配列上にサイレント変異を導入したドナーを用いてSNGD法によるゲノム編集を行った場合、野生型の配列を持つドナーを用いたゲノム編集と比べ、効率が著しく低下した。これにより、SNGD法で相同組換え様の修復機構を用いていることが示された。
その他、DSB修復経路選択に関わるBRCA1および53BP1の相互作用および両者を欠損する細胞における、修復機構の解析(RAD51のDNA損傷部位への局在機構など)を行った。さらに、RNF168のDSB部位への局在機構について、結晶構造解析結果を基に細胞内での分子機構の一部を明らかにした。また、共同研究により、DNA架橋修復におけるユビキチンの関与を解明した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

DNA2本鎖損傷における修復機構として、53BP1をDNA損傷部位にリクルートする因子であるRNF168がDSB部位に局在する分子機構の解明に迫るだけの分子生物学的根拠を得たこと、BRCA1および53BP1両者を欠損する細胞における修復機構が明らかになってきたこと、共同研究で53BP1・RIF1とBRCA1のDNA損傷部位への時空間的変化が重要であることを示し、また、新たなE3ユビキチンリガーゼがDNA架橋修復を制御すること、そして、高効率かつ正確なゲノム編集法の開発に成功し、目標十分に達成したと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

SNGD法によるゲノム編集法の分子機構の解明に挑むとともに、これまでレポーター遺伝子を用いて評価していたものを、エンドの遺伝子の編集により評価する。また、ノックアウト細胞を用いたDSB応答について、これまで使用していないDNA障害性薬剤への感受性評価や、DNA損傷因子のDSB部位への局在機構を解明し、研究を完成させる。

  • Research Products

    (13 results)

All 2018 2017 2016 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 2 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 4 results) Remarks (1 results) Patent(Industrial Property Rights) (1 results)

  • [Int'l Joint Research] ネブラスカ大学(米国)

    • Country Name
      U.S.A.
    • Counterpart Institution
      ネブラスカ大学
  • [Journal Article] Structural insights into two distinct binding modules for Lys63-linked polyubiquitin chains in RNF1682018

    • Author(s)
      Takahashi Tomio S.、Hirade Yoshihiro、Toma Aya、Sato Yusuke、Yamagata Atsushi、Goto-Ito Sakurako、Tomita Akiko、Nakada Shinichiro、Fukai Shuya
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 9 Pages: 170

    • DOI

      10.1038/s41467-017-02345-y

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Precise and efficient nucleotide substitution near genomic nick via noncanonical homology-directed repair2017

    • Author(s)
      Nakajima Kazuhiro、Zhou Yue、Tomita Akiko、Hirade Yoshihiro、Gurumurthy Channabasavaiah B.、Nakada Shinichiro
    • Journal Title

      Genome Research

      Volume: 28 Pages: 223~230

    • DOI

      10.1101/gr.226027.117

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] RFWD3-Mediated Ubiquitination Promotes Timely Removal of Both RPA and RAD51 from DNA Damage Sites to Facilitate Homologous Recombination2017

    • Author(s)
      Inano Shojiro、Sato Koichi、Katsuki Yoko、Kobayashi Wataru、Tanaka Hiroki、Nakajima Kazuhiro、Nakada Shinichiro、Miyoshi Hiroyuki、Knies Kerstin、Takaori-Kondo Akifumi、Schindler Detlev、Ishiai Masamichi、Kurumizaka Hitoshi、Takata Minoru
    • Journal Title

      Molecular Cell

      Volume: 66 Pages: 622~634.e8

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2017.04.022

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] BRCA1 Directs the Repair Pathway to Homologous Recombination by Promoting 53BP1 Dephosphorylation2017

    • Author(s)
      Isono Mayu、Niimi Atsuko、Oike Takahiro、Hagiwara Yoshihiko、Sato Hiro、Sekine Ryota、Yoshida Yukari、Isobe Shin-Ya、Obuse Chikashi、Nishi Ryotaro、Petricci Elena、Nakada Shinichiro、Nakano Takashi、Shibata Atsushi
    • Journal Title

      Cell Reports

      Volume: 18 Pages: 520~532

    • DOI

      10.1016/j.celrep.2016.12.042

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] Single Nicking of a Target Gene and Donor Plasmid Enables Precise and Efficient Nucleotide Substitution by Non-Canonical Homology-Directed Repair2017

    • Author(s)
      Shinichiro Nakada
    • Organizer
      US-Japan DNA repair meeting
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ニックによる正確で効率のよいゲノム編集法では 非古典的なHDRが利用されている2017

    • Author(s)
      中田慎一郎
    • Organizer
      分子生物学会
    • Invited
  • [Presentation] 非典型的なhomology directed repairによりDNA2本鎖切 を起こさずにゲノム編集が可能である2017

    • Author(s)
      中嶋裕宏、周越、中田慎一郎
    • Organizer
      ゲノム編集学会
  • [Presentation] ニックを入れたドナープラスミドを用いて標的遺伝子上の1つのニックから高効率かつ安全な塩基置換を行う2016

    • Author(s)
      中田慎一郎
    • Organizer
      分子生物学会
    • Invited
  • [Presentation] Choice of DNA double-strand break repair pathway by E3 ubiquitin ligase RNF8.2016

    • Author(s)
      Shinichiro Nakada
    • Organizer
      日本癌学会
    • Invited
  • [Presentation] RNF8 regulates sensitivity of BRCA153BP1 knockout cells to DNA cross-linking agents2016

    • Author(s)
      Kiyoko Kato, Shinichiro Nakada
    • Organizer
      Fanconi Anemia Symposium
    • Int'l Joint Research
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.bcr.med.osaka-u.ac.jp

  • [Patent(Industrial Property Rights)] ゲノム編集方法2016

    • Inventor(s)
      中田慎一郎
    • Industrial Property Rights Holder
      中田慎一郎
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      特願2016-141482

URL: 

Published: 2018-12-17  

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