2016 Fiscal Year Annual Research Report
CRISPR-mediated reading and writing of the epigenome
| Project/Area Number |
26250038
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | dCas9 / BiFC / エピジェネティクス |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
【ランダムプライミングによらないPBATの開発】ssDNAの3'末端にTdTを用いて3'-azido-dGTPを付加した後で、クリックケミストリーを用いて5'-エチニル化オリゴヌクレオチドと連結する基盤技術TdT-assisted Chemical ssDNA (TCS) ligationを開発して論文発表した。
【部位特異的エピ変異導入】出芽酵母のCUP1遺伝子は銅耐性を付与する遺伝子で、銅イオンによってプロモーターにリクルートされる転写因子CUP2によって誘導される。cup2欠損株中で、dCas9にヒストンアセチル化酵素p300を付加したdCas9-p300をCUP1遺伝子にターゲティングしたところ、銅感受性が部分的に抑圧された。この結果は、プロモータのヒストンアセチル化亢進によってCUP１遺伝子の基底発現レベルが上昇したものと考えられた。
【エピジェネティック修飾の部位特異的生細胞可視化】高感度生細胞可視化用にmNeonGreen (mNG) による二分子蛍光相補法（BiFC）を開発した。細胞内存在量が32分子に過ぎない出芽酵母セントロメア特異的ヒストンバリアントCse4に適用したところ、タイムラプス観察が可能な感度を持つことが示された。更に、CUP1遺伝子プロモータにターゲティングしたdCas9-CUP2間のBiFCを検討した。当初、CUP2-mNG融合タンパク質の局在異常等のトラブルが生じたが、株の変更で問題を解決できた。その結果、銅の添加によってdCas9-CUP2間のBiFCが特異的に誘導されることが確認できた。これにより、dCas9を利用して特定のゲノム座位近傍へのタンパク質結合をBiFCによって生細胞観察できることが実証された（投稿準備中）。現在、ヒストンのアセチル化をリーダータンパク質-dCas9間のBiFCで検出する試みを進行中である。
|
| Research Progress Status |
翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。
|
Research Products
(6 results)
-
-
-
-
[Journal Article] DNA Methylome Analysis Identifies Transcription Factor-Based Epigenomic Signatures of Multilineage Competence in Neural Stem/Progenitor Cells.2017
Author(s)
Sanosaka T, Imamura T, Hamazaki N, Chai M, Igarashi K, Ideta-Otsuka M, Miura F, Ito T, Fujii N, Ikeo K, Nakashima K
-
Journal Title
Cell Reports
Volume: 20
Pages: 2992-3003
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
-
