2015 Fiscal Year Annual Research Report
脱窒土壌細菌でのN2O生成鍵遺伝子水平伝播の検証と化学物質によるN2O発生制御
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26252058
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
橋床 泰之 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40281795)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村井 勇太 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 助教 (20707038)
内田 義崇 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (70705251)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | N2O放出ホットスポット / 遺伝子水平伝播 / napA / nirB / ペリプラズマ酵素 / N2O抑制活性天然物 / アリルイソチオシアネート / N2O放出亢進活性天然物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
N2O放出ホットスポットの土壌から分離したN2O生成細菌や窒素固定細菌の無機窒素代謝のタイプを分類し，それらグループ分けしたN2O生成細菌株のうち，代表的性質を示すもの2株の，次世代シーケンサーによるゲノムDNAパイロシーケンシングを行い，得られた配列情報からN2O放出能獲得に至る再構築遺伝子の共通点を探索した。特に脱窒関連遺伝子群それぞれの由来を精査した。N2O生成や他の酸化還元を伴う窒素や炭素の無機代謝に寄与する主要な鍵遺伝子（napA, nirB, nifH, mcrA等）のうち，明らかに宿主由来でないものについては，それら機能性遺伝子のドナーとなった微生物の探索を試みたが，熱帯泥炭土壌から分離したPseudoxanthomonas属細菌は，ドナーと遺伝子の型が一致しなかった。
また，特に土壌に抵抗なく散布できる除草剤や作物根由来の二次代謝産物中に，極微量（2 μM以下）でN2O生成抑制に効果のある化学資材を探索し，アリルイソチオシアネートとブチルイソチオシアネートをN2O放出抑制物質として見出した。これらは，有望な薬剤として2014年に報告したパラコートの約10倍量で十分効果を発揮した。しかしながら，メチルイソチオシアネートやC5以上のエキメチレン型直鎖アルケン側鎖では，活性はこれらの1/10以下に低下していた。また，ダイコン幼苗にはN2O放出量を上昇させる活性が認められた。この活性上昇は，菌体増殖効果だけでは説明できなかった。これらの効果を明らかにするため，特に活性の強かったハツカダイコン芽生え地上部のメタノール抽出物について分画を試みた結果，メタノール抽出物のメタノール再溶解不溶-水可溶部に強い促進活性が認められ，この分画物を逆相ODSカラムによって分画したところ，素通り画分に続く2% MeOH溶液溶出画分に活性が認められ，活性成分の濃縮が可能であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
北方泥炭から強力な亜酸化窒素放出細菌が見つかった。加えて，本研究のために導入した次世代シーケンサーによる解析が順調に稼働しているため，遺伝子水平伝播の研究はこの2年間で大きく進展すると考えられる。また，多くの遺伝子マーカーを入手したことで，遺伝子水平伝播に係る環境要因の探索にも取りかかることができる。N2O生成抑制化学資材の探索において，キガラシ芽生え地上部MeOH抽出物に強いN2O放出抑制効果が見出されたため，キガラシ芽生えの主たる二次代謝産物であるシニグリンとアリルイソチオシアネートについて効果を調べたところ，カラシ油本体であるアリルイソチオシアネートのみ30 マイクロM濃度で完全なN2O抑制が認められた。ところが，同じアブラナ科でもハツカダイコン芽生え地上部はN2O放出を非常に強く亢進し，細菌による脱窒過程を活性化させるシニグリンとは別の水溶性化合物が存在することが示された。この思いがけない現象の発見とともに，N2O放出ホットスポットの出現がどのような土壌・植生環境によるのかを着実に明らかにしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度の研究では，パイロシーケンスによる菌相解析と機能性遺伝子のドナーとなる細菌や古細菌の分離，N2O生成抑制物質の検索とその標的分子の解明を試みたが，平成28年度も，資材探索を継続する。脱窒関連遺伝子を持ったドナー微生物とN2O放出活性を獲得した環境微生物間の鍵遺伝子水平伝播については，実験室環境で酸性泥炭土壌や低温凍結融解環境を再現し，その遺伝子水平伝播要因の特定を行う。また，脱窒遺伝子群の水平伝播を実験室で再現することに成功した場合，その水平伝播機構系を利用し，土着の脱窒細菌がもつN2O還元酵素遺伝子（nosZなど）を積極的にアクセプター側に取り込ませるためのトライアルを行う。また，引き続いて根圏の窒素保持のために植物が根から，あるいは根圏微生物が根圏土壌に放出する脱窒抑制化合物を探索する。特にトウモロコシやソルガム，イネを脱窒抑制活性物質の検索系にかける。イネからは根内共生性の高いBurkholderia kururiensisを同定しているため，これがN2O生成Burkholderia属細菌に対して干渉作用を示すか否かを検証する。また，得られた生理活性物質に光反応基を導入し，その標的となっている酵素の検出・同定に用いる。この１年間で，少なくともN2O生成ホットスポットの不完全脱窒細菌の活動を抑制するための簡易法を開発し，畑地で実証したい。
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