ダウン症候群に伴う急性巨核球性白血病の多段階発症の分子機構

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26253061
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 伊藤 悦朗 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20168339)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土岐 力 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50195731) ; 照井 君典 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00333740) ; 金崎 里香 弘前大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60722882)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ダウン症 / 急性巨核芽球性白血病 / TAM / GATA1 / コヒーシン / CTCF / EZH2

Outline of Annual Research Achievements

Down症新生児の約10％に前白血病TAMが発症し、その20％は急性巨核芽球性白血病（DS-AMKL）を発症する。我々は、最近、DS-AMKLではGATA1に加え、コヒーシン複合体／CTCF、EZH2などのエピゲノムの制御因子、およびシグナル伝達系分子をコードする遺伝子群に高頻度に変異が生じていることを発見した。本研究の目的は、DS-AMKL特異的遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明して、画期的な新規治療法を開発することである。TAMとDS-AMKLでは、GATA1変異によりN末端を欠失したGATA1sタンパクのみが発現している。昨年度は、GATA1s変異による白血病発症の仕組みを解明するため、CRSPR/Cas9システムを用いてゲノム編集を行い、巨核芽球系細胞株K562にGATA1s変異を導入し、GATA1sのみが発現する細胞亜株を樹立した。興味深いことに、GATA1s変異を有するすべての細胞亜株で、TAM細胞の増殖に重要なサイトカインSCFの受容体であるc-KITの発現が上昇していた。
本年度はさらに解析を続け、以下の結果を得た。ChIP-seqとプロモーター・エンハンサー解析により、c-KIT遺伝子の5'上流域に機能的なGATA結合領域（-185 kb, -115 kb, -109 kb, -87 kb）を同定した。GATA2はKITの発現を誘導し、GATA1はGATA2の発現を抑制することが知られている。しかし、GATA1s細胞亜株では、GATA2の有意な発現上昇は認められなかった。GATA1s細胞亜株では、これらの領域へのGATA1の結合がやや低下していたが、GATA2の結合は両者で差は認められなかった。これらの結果は、GATA1のN末端がKITの適正な発現制御に不可欠であり、GATA2を介さないKIT発現抑制の仕組みがあることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の目的は、画期的な新規治療法を開発するためにDS-AMKL特異的遺伝子変異の機能解析を行い、白血病の多段階発症の分子機構を解明することである。本年度は、以下の研究成果が得られ、概ね順調に研究が進展している。
昨年度は、GATA1変異を持たない巨核芽球系細胞株K562に、CRISPR/Cas9を用いてTAM/DS-AMKLにみられるGATA1変異を導入した。その結果、GATA1sのみが発現するK562細胞亜株を複数樹立した。興味深いことに、GATA1s変異を有する全ての細胞株で、TAM細胞の増殖に重要なサイトカインSCFの受容体であるc-KITの発現が上昇していた。c-KITの発現は、GATA1により抑制され、GATA2により促進されることが報告されている。即ち、GATA1とGATA2は同じGATA配列に競合的に結合し、c-KIT遺伝子の発現を正反対にコントロールしている。そこで、GATA1sとGATA1の機能の違いを明らかにするため、本年度はChIP-seqの技術を確立し、K562親株とGATA1s細胞亜株を用いてGATA1とGATA1sの標的遺伝子の差異を検索した。我々はGATA1のC末端に対する抗体を使用することにより、内因性のGATA1sのChIP-seqに世界で初めて成功した。解析の結果、GATA1とGATA1sの結合ピークはそれぞれ1368 箇所と816箇所であり、631箇所は重複していたが明らかな差が認められた。c-KIT遺伝子の5'上流域にGATA1結合領域を複数同定し、GATA2も同部位に結合していることを見出した。K562親株とGATA1s亜株では、これらの領域へのGATA1の結合がやや低下していたが、GATA2の結合は両者に差は認められなかった。

Strategy for Future Research Activity

DS-AMKLではGATA1に加え、コヒーシン複合体やEZH2などをコードする遺伝子群に高頻度に変異が生じている。本年度は、この２年間の研究成果をもとに、白血病の多段階発症の分子機構を解明する。まず、前年度CRISPR/Cas9システムで樹立したGATA1sのみが発現するK562細胞亜株を用いて、GATA1s変異が巨核球系細胞の増殖を促す仕組みを解明する。
GATA1s変異を有する全ての細胞株で、TAM細胞の増殖に重要なサイトカインSCFの受容体であるc-KITの発現が上昇していた。c-KITの発現は、GATA1により抑制され、GATA2により促進されることが報告されている。即ち、GATA1とGATA2は同じGATA配列に競合的に結合し、遺伝子発現制御を正反対にコントロールしている。しかし、GATA1s細胞亜株のc-KIT発現誘導は、GATA switchingでは説明つかないことが明らかとなった。本年度は、新たに開発されたenChIP法とK562細胞系を用いて、GATA1あるいはGATA1s を介してc-KIT遺伝子5'上流域のGATA結合領域とループ形成をしているゲノム領域を明らかにする。その後、TAM細胞でも同様の解析を行う。
CRISPR/Cas9によるゲノム編集を用いて、TAM細胞のCTCF、コヒーシンやEZH2をコードする遺伝子をノックアウトし、in vitro培養系で増殖能や遺伝子発現などについて解析する。また、NOGマウスへの移植も行う。DS-AMKLで認められたCTCFやコヒーシンの遺伝子変異は、多くがドミナントネガティブと考えられるため、それらの変異遺伝子のレトロウイルス発現ベクターを構築し、同様の実験を行う。

Research Products

• [Journal Article] Spectrum of clinical and genetic features of patients with inherited platelet disorder with suspected predisposition to hematological malignancies: a nationwide survey in Japan. (2016)
  • Author(s): Yoshimi A, Toya T, Nannya Y, Takaoka K, Kirito K, Ito E, Nakajima H, Hayashi Y, Takahashi T, moriya-Saito A, Suzuki K, Harada H, Komatsu N, Usuki K, Ixhikawa M, Kurokawa M.
  • Journal Title: Annals of Oncology Volume: 27 Pages: 887-895
  • DOI: 10.1093/annonc/mdw066
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Preserved High Probability of Overall Survival with Significant Reduction of Chemotherapy for Myeloid Leukemia in Down Syndrome: A Nationwide Prospective Study in Japan (2016)
  • Author(s): Taga T, Watanabe T, Tomizawa D, Kudo K, Terui K, Moritake H, Kinoshita A, Iwamoto S, Nakayama H, Takahashi H, Shimada A, Taki T, Toki T, Ito E, Goto H, Koh K, Saito AM,Horibe K, Nakahata T, Tawa A, Adachi S.
  • Journal Title: Pediatr Blood Cancer. Volume: 63 Pages: 248-254
  • DOI: 10.1002/pbc.25789
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ALDH2 polymorphism in patients with Diamond-Blackfan anemia in Japan. (2016)
  • Author(s): Ikeda F, Toki T, Kanezaki R, Terui K, Yoshida K, Kanno H, Ohga S, Ohara A, Kojima S, Ogawa S, Ito E.
  • Journal Title: Int J Hematol. Volume: 103 Pages: 112-114
  • DOI: 10.1007/s12185-015-1891-0
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transient myeloproliferative disorder with partial trisomy 21 (2015)
  • Author(s): Takahashi T, Inoue A, Yoshimoto J, Kanamitsu K, Taki T, Imada M, Yamada M, Ninomiya S, Toki T, Terui K, Ito E, Shimada A.
  • Journal Title: Pediatr Blood Cancer Volume: 62 Pages: 2021-2024
  • DOI: 10.1002/pbc.25624
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and telomere length predicts response to immunosuppressive therapy in pediatric aplastic anemia. (2015)
  • Author(s): Narita A, Muramatsu H, Sekiya Y, Okuno Y, Sakaguchi H, Nishio N, Yoshida N, Wang X, Xu Y, Kawashima N, Doisaki S, Hama A, Takahashi Y, Kudo K, Moritake H, Kobayashi M, Kobayashi R, Ito E, Yabe H, Ohga S, Ohara A, Kojima S.
  • Journal Title: Haematologica Volume: 100 Pages: 1546-1552
  • DOI: 10.3324/haematol
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical and genetic features of dyskeratosis congenita, cryptic dyskeratosis congenita, and Hoyeraal-Hreidarsson syndrome in Japan (2015)
  • Author(s): Yamaguchi H, Sakaguchi H, Yoshida K, Yabe M, Yabe H, Okuno Y, Muramatsu H, Takahashi Y, Yui S, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Inokuchi K, Ito E, Ogawa S, Kojima S.
  • Journal Title: Int J Hematol. Volume: 102 Pages: 544-552
  • DOI: 10.1007/s12185-015-1861-6
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparison of long-term outcomes between children with aplastic anemia and refractory cytopenia of childhood who received immunosuppressive therapy with antithymocyte globulin and cyclosporine (2015)
  • Author(s): Hama A, Takahashi Y, Muramatsu H, Ito M, Narita A, Kosaka Y, Tsuchida M, Kobayashi R, Ito E, Yabe H, Ohga S, Ohara A, Kojima S
  • Journal Title: Haematologica Volume: 100 Pages: 1426-1433
  • DOI: 10.3324/haematol.2015.128553
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutations in the gene encoding the E2 conjugating enzyme UBE2T cause Fanconi anemia (2015)
  • Author(s): Hira A, Yoshida K, Sato K, Okuno Y, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Miyano S, Shimamoto A, Tahara H, Ito E, Kojima S, Kurumizaka H, Ogawa S, Takata M, Yabe, H, Yabe M
  • Journal Title: Am J Hum Genet Volume: 96 Pages: 1001-1007
  • DOI: 10.1016/j.ajhg.2015.04.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Loss of function mutations in RPL27 and RPS27 identified by whole-exome sequencing in Diamond-Blackfan Anemia (2015)
  • Author(s): Wang R, Yoshida K, Toki T, Sawada T, Uechi T, Okuno Y, Sato-Otsubo A, Kudo K, Kamimaki I, Kanezaki R, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Terui K, Sato T, Iribe Y, Ohga S, Kuramitsu M, Hamaguchi I, Ohara A, Hara J, Goi K, Matsubara K, Koike K, Miyano S, Kenmochi N, Ogawa S, Ito E, et al.
  • Journal Title: Br J Haematol Volume: 168 Pages: 854-864
  • DOI: 10.1111/bjh.13229
  • Peer Reviewed
• [Presentation] DNA methylation state correlates with progression of myeloid leukemia in Down syndrome (2015)
  • Author(s): Saida S, Nakamura M, Toki T, Arai Y, Terui K, Yoshida Y, Ogawa S, Nakahata T, Heike T, Watanabe K, Watanabe A, Ito E
  • Organizer: 第57回アメリカ血液学会
  • Place of Presentation: オーランド（米国）
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Prospective study of 168 infants with transient abnormal myelopoiesis with Down syndrome: Japan Pediatric Leukemia/Lymphoma Study Group, TAM-10 study (2015)
  • Author(s): Muramatsu H, Watanabe T, Hasegawa D, Park M, Iwamoto S, Taga T, Ito E, Toki T, Terui K, Yanagisawa R, Koh K, Saito A, Horibe K, Hayashi Y, Adachi S, Mizutani S, Watanabe K
  • Organizer: 第57回アメリカ血液学会
  • Place of Presentation: オーランド（米国）
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] TAMの最新情報 (2015)
  • Author(s): 伊藤 悦朗
  • Organizer: 第60回日本新生児成育医学会（教育講演）
  • Place of Presentation: いわて県民情報交流センター「アイーナ」，盛岡地域交流センター「マリオス」，ホテルメトロポリタン盛岡（盛岡市）
  • Year and Date: 2015-11-23 – 2015-11-25