2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26282136
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
石橋 哲 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (30533369)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
和田 健彦 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (20220957)
横田 隆徳 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90231688)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 脳血管障害 / 核酸医薬 / 虚血応答性核酸 / 脳梗塞 / 動物モデル / マウス / 人工核酸 / pH |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究において、脳梗塞に特異的な病態にのみ効果を発現する虚血応答性核酸医薬を開発し、現在まで有効な治療法が開発できていなかった脳梗塞に対する神経保護療法を実現化させる。具体的には、医工の連合により現段階で世界最高水準のin vivo遺伝子抑制効果を持つ独自のヘテロ核酸分子構造に、pH応答性人工核酸技術を導入した「細胞内環境応答型核酸医薬」を開発して、虚血脳組織に部位/時間特異的に治療効果を発揮する、全く新しい発想の脳梗塞治療薬を創薬する。
平成26年度は、pH応答性人工核酸の作成及びチューニングを行った。具体的には、分子内導入フェニルボロン酸部位への置換基導入など分子設計･合成によりpH5.8-7.4程度まで、目的とするpHが変化した場合であっても対応出来るようになった。すなわち、当初はpH6.5程度が虚血脳での目標とするpHであったが、梗塞周辺のペナンブラ領域、あるいは脳梗塞病変が小さい場合などpH低下が乏しい場合もあり、その目標とする病変部位のpHに対して、最適なpH応答性人工核酸を選択出来るようになった。
次に、主には神経細胞（Neuro2a）の培養細胞系を使用しBCECF（pH感受性蛍光指示薬）などで細胞内pHを測定した。虚血負荷（OGD: oxygen glucose deprivation）の条件を詳細に検討し、当初予定していた細胞内pH「6.5」への低下を実現出来るようになり、pH応答性人工核酸の遺伝子抑制効果を確認し得た。
さらに、当初は平成27年度に行う予定であったが、マウス脳梗塞モデルも作成し、実際に経静脈的に投与した核酸が脳内に侵入出来るかどうかを確認した。脳内への分布が達成されなければ、我々の検討の実現が難しくなるからである。実際にin vivo脳梗塞モデルであっても急性期に脳血管関門が破綻し、投与した蛍光色素付き核酸が虚血脳内に分布し、主には神経細胞に分布していた。遺伝子抑制効果も虚血脳で認められ、今後のプランは実現可能と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、もともとin vitro 虚血細胞モデルでの虚血応答性遺伝子抑制効果の検証と至適細胞内pH範囲の検討であった。pH応答性人工核酸は分子内導入フェニルボロン酸部位への置換基導入などにより、適応可能な細胞内pHの範囲が拡大した。また、in vitro 虚血細胞モデルでの検討も順調に進行している。
平成27年度に検討予定であったin vivo マウス脳梗塞モデルを使用した検討も、平成26年度にすでに予備実験として先行して行ったが、直接脳内でなく経静脈的に核酸を投与した場合であっても、梗塞脳では脳血管関門が破綻しているために脳内に分布すること、遺伝子抑制効果を得られることを確認でき、今後の我々の検討が実現可能であるという結果を得ることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウス脳梗塞モデルでの細胞特異的遺伝子抑制効果の確認
実際のマウス脳梗塞モデルに梗塞周辺部位pHiに最適化された虚血応答性核酸を経静脈的に投与し、本治療概念がin vivoで予想通りの遺伝子抑制効果を発現するかどうか、培養細胞と同様に中枢神経系の各細胞種に特異的に発現する遺伝子（BACE1、GFAP、SRB1）の発現抑制効果を検討する。
すでに我々はヘテロ核酸の静脈投与で従来のASOの200-1000倍、VE-siRNAの約100倍（ED50として）の飛躍的な有効性の上昇に成功している。この飛躍的な有効性をもった遺伝子抑制効果を虚血反応選択的、虚血部位選択的に発揮させることが目的である。また、DNA鎖の5’末端やRNA鎖の3’末端に蛍光色素でラベルしたヘテロ核酸とpH感受性蛍光色素の２波長領域で２分子をラベルして、梗塞脳内へのヘテロ核酸集積をin vivoコンフォーカル顕微鏡で経時的に、微細なヘテロ核酸の脳組織内分布や細胞内分布を我々の保有する超感度蛍光顕微鏡（STORM）で脳組織病理学的に検索する。さらにその目的細胞内への導入と有効性をヘテロ核酸や標的mRNAに対するノザンブロットと定量的RT-PCRで、蛋白レベルではウエスタンブロットや免疫組織学的に検討する。もし、細胞内への導入が不十分である場合はヘテロ核酸のRNA鎖に神経細胞・グリア細胞に導入有効性を有することをすでに報告しているビタミンEをリガンドとして結合させたい。
また、虚血応答性ヘテロ核酸の有効性とペナンブラ領域のpHiの経時的変化との相関関係を明らかにして、さらなる核酸構造や投与の時間的タイミングの最適化を行う。
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| Causes of Carryover |
平成26年度科学研究費補助金は、計画通り研究が進行し全てを使用した。学術研究助成基金助成金に関しても、核酸の作成などにより100万円程度支出した。マウス脳梗塞モデルでの遺伝子抑制効果を検討が予定より早く進んだ場合に、非常に多くの核酸を注文/作成（200-300万円）する必要があったが、平成26年度は予定通り培養細胞での検討を中心に行ったため、多く見積もった学術研究助成基金助成金を、大量の核酸の注文/作成が必要な平成27年度に繰り越し研究を進めることとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成26年度の結果により虚血反応性核酸は予想通りのpH値により最も遺伝子抑制効果を生じること、また投与した核酸は虚血脳内に侵入し、神経細胞内に入ることを確認出来たことから、我々の研究戦略により虚血脳特異的に遺伝子することが出来ることが予想される。今後は、臨床応用を目指し、in vivoでの検討が必要である。
平成27年度は虚血反応性核酸のpHによる遺伝子抑制効果のチューニング、in vivo マウス脳梗塞モデルへの新世代核酸の投与により、培養細胞研究の数百倍の核酸の注文/作成が必要となる。そのため、平成27年度の科学研究費補助金及び、繰り越した学術研究助成基金助成金に関しても多くを平成27年度に使用する予定である。
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[Journal Article] Chimeric Antisense Oligonucleotide Conjugated to α- Tocopherol2015
Author(s)
Nishina T, Numata J, Nishina K, Yoshida-Tanaka K, Nitta K, Piao W, Iwata R, Ito S, Kuwahara H, Wada T, Mizusawa H, Yokota T
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Journal Title
Mol Ther Nucleic Acids
Volume: 4
Pages: e220
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Double helices of a pyridine-appended zinc chlorophyll derivative2014
Author(s)
Shinozaki Y, Richards G, Ogawa K, Yamano A, Ohara K, Yamaguchi K, Kawano S, Tanaka K, Araki Y, Wada T, Otsuki J.
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Journal Title
J Am Chem Soc
Volume: 43
Pages: 5262-5
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Intrathecal AAV Serotype 9-mediated Delivery of shRNA Against TRPV1 Attenuates Thermal Hyperalgesia in a Mouse Model of Peripheral Nerve Injury2014
Author(s)
Hirai T, Enomoto M, Kaburagi H, Sotome S, Yoshida-Tanaka K, Ukegawa M, Kuwahara H, Yamamoto M, Tajiri M, Miyata H, Hirai Y, Tominaga M, Shinomiya K, Mizusawa H, Okawa A, Yokota T
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Journal Title
Mol Ther
Volume: 22
Pages: 409-419
DOI
Peer Reviewed
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