2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26290045
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| Research Institution | Aichi Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
青木 正博 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 部長 (60362464)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐久間 圭一朗 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 主任研究員 (90402891)
藤下 晃章 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 研究員 (50511870)
梶野 リエ 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 研究員 (20633184)
小島 康 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 主任研究員 (30464217)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 大腸がん / 転移 / 動物実験 / トランスポゾン / 遺伝子改変マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定
前年度までに、マウス大腸がん細胞株CMT93においてHnrnpllがCd44 pre-mRNAの選択的スプライシングを制御することを見出した。本年度はヒト大腸がん細胞でも同様の現象がみられるか検証したところ、複数のヒト大腸がん細胞株において、HNRNPLLがCD44 pre-mRNAと結合し、HNRNPLLのノックダウンによってCD44のエキソンv6の発現が増加する結果を得た。一方、がん細胞の浸潤促進要因として知られる上皮間葉転換(Epithelial-mesenchymal transition: EMT)とHNRNPLLの関係を検討した。大腸がん細胞株にin vitroでEMTを誘導するとHNRNPLLの発現が抑制された。さらに、臨床検体の免疫染色によって、浸潤先端のE-cadherinの発現が低下したがん細胞の一部でHNRNPLLの発現低下が認められ、HNRNPLLの発現低下とEMTの関係が示唆された。
2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定
昨年度の予備検討で浸潤が認められたLBAPマウスについてさらに解析した。7匹のマウスにタモキシフェンを投与し、4～7ヶ月後に腸管腫瘍形成・浸潤・転移を調べたが、遠隔転移は認められなかった。組織学的解析により2匹のマウスで浸潤性腺がんを認めたが粘膜下層に達する程度であった。一方、腫瘍DNAの解析からPiggyBacトランスポゾンの転移自体は確認できた。以上の結果から、LBAP（VBAP）を用いたPiggyBacトランスポゾンによる転移関連遺伝子の探索は、時間的制約（浸潤・転移に必要な変異が蓄積する期間）の点から困難と考えられ、当初の予定通りLBAPにSmad4の変異を加えたLBSAP およびVBSAPマウスを用いた解析を行うべく交配を進めており、最終段階まで来ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定」については順調に進展しており、shRNAライブラリを用いたスクリーニングにより同定された転移抑制因子候補HNRNPLLについて、ヒト大腸がん細胞においても、その発現低下がCD44のエクソン6の発現増加を誘導して浸潤・転移能亢進を引き起こすことを示すことができた。また、大腸がん細胞の上皮間葉転換（EMT)に伴ってHNRNPLLの発現が低下することも見出し、臨床検体を用いた解析においても浸潤先端にE-cadherinとHNRNPLLの発現が低下したがん細胞が存在することを示すことができた。
「2. トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定」については当初の予定よりやや遅れている。これは、beta-catenin変異のみにより発症した腸管腫瘍にトランスポゾンを導入しただけでは転移の成立に至らなかったことによるもので、想定されていた範囲内である。さらにSmad4・Kras・p53などの変異を導入したマウスの作出は順調に進んでおり、それらのマウスを用いた解析により遅れを取り戻すことは可能であると考えている。
以上を総合的に判断して、本研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定
前年度までの研究の続きとして、CD44エキソンv6の発現増加による浸潤促進の機序や、EMTによるHNRNPLLの発現低下機序について検討を追加する。HNRNPLLによって制御を受けるCD44以外の遺伝子群を次世代シーケンサーやRNA免疫沈降法を用いて同定し、タンパクレベルのアイソフォーム発現変化をウエスタンブロットで確認する。得られた遺伝子群について、パスウェイ解析などの網羅的解析による考察と、データベースや遺伝学的実験手法を駆使した個々の遺伝子についての検証を通して、HNRNPLLの抑制がもたらすスプライシング変化によってがん細胞がどのように悪性化するのか包括的な理解を試みる。
2. トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定
これまでVillin-creERT2; Ctnnb+/loxEX3 マウス(VBマウス) とLgr5-creERT2マウス(LBマウス)に、PiggyBacトランスポゾンが導入されたATP1-S2/Rosa26-LSL-PBaseマウス(APマウス)を交配したVBAP・LBAPマウスを用いて解析してきたが。腸管腫瘍が悪性化するまでマウスが生存できなかった。今後は大腸がんで高頻度に変異が認められるSmad4変異マウス(Smad4lox/lox)と交配させたLBSAP およびVBSAPマウスの解析を行う。同様にKras・p53遺伝子の変異マウス（KrasLSLG12D/ p53 lox/lox/Smad4lox/lox マウス：KPSマウス）とも交配させVBAPKPSマウスを作出する。これらのマウスにおいて高頻度で浸潤・転移が確認できれば共通挿入部位CISsを同定し、浸潤・転移に関わる遺伝子のスクリーニングを行う。
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| Causes of Carryover |
483円が残ったが、少額のため、翌年度に必要な物品の購入に充てることにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額は483円と少額であるため、使用計画に変更はない。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] Genomic loss of DUSP4 contributes to the progression of intraepithelial neoplasm of pancreas to invasive carcinoma.2016
Author(s)
Hijiya N, Tsukamoto Y, Nakada C, Tung NL, Kai T, Matsuura K, Shibata K, Inomata M, Uchida T, Tokunaga A, Amada K, Shirao K, Yamada Y, Mori H, Takeuchi I, Seto M, Aoki M, Takekawa M, Moriyama M.
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Journal Title
Cancer Res.
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed
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