2016 Fiscal Year Annual Research Report
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26290045
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| Research Institution | Aichi Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
青木 正博 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 部長 (60362464)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
梶野 リエ 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 研究員 (20633184)
小島 康 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 主任研究員 (30464217)
藤下 晃章 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 主任研究員 (50511870)
佐久間 圭一朗 愛知県がんセンター(研究所), 分子病態学部, 主任研究員 (90402891)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 大腸がん / 転移 / 動物実験 / トランスポゾン / 遺伝子改変マウス / スプライシング / 上皮間葉転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定
前年度までの研究成果のうち、①新規大腸がん転移抑制因子HNRNPLLの同定、②HNRNPLLのCD44v6のスプライシングへの関与、③HNRNPLLの発現低下と上皮間葉転換とのリンクについて、本年度末に「Gut」誌に論文発表した。本年度はその続きとして、HNRNPLLによってスプライシング制御を受ける遺伝子群の網羅的同定を試みた。次世代シーケンシングとRNA免疫沈降法を用いた検討により、HNRNPLLによってスプライスバリアントの発現量比が変化する遺伝子群、そして遺伝子のトータルの発現量自体が変化する群の存在を確認した。興味深いことに、それらの変化の少なくとも一部は上皮間葉転換によって生じる細胞の性質変化を説明し得るものであった。
2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定
前年度までにLBAPマウスを作出し、腸管腫瘍の浸潤を認めていたが、転移は確認できなかった。今年度はさらに転移が発生しやすい環境を整備するため、大腸がんで高頻度に変異が認められる３つの遺伝子の変異マウス（KrasLSLG12D/p53lox/lox/Smad4lox/lox マウス：KPSマウス）とVillin-creERT2マウスとを導入し、VBAPKPSマウスを作出した。興味深いことに、VBAPKPSマウスでは肝臓に転移した個体が認められたが（14匹中7匹）、作成する過程において産まれて来たVBAPPSでは転移した個体が認められなかった（5匹中0匹）ことから、大腸がん転移においてKras変異が重要であること、およびトランスポゾンによって影響を受ける遺伝子の関与することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定」については順調に進展しており、本年度の目標である「HNRNPLLによって制御を受けるCD44以外の遺伝子群の同定」は概ね達成できた。同定した遺伝子の発現変化あるいはスプライシング変化が大腸がん細胞の浸潤・転移能にどのような影響を与えるのかについては、次年度も引き続き検証を進める。
「2. トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定」についても、当初の予定よりはやや遅れているものの、かなり遅れを取り戻したと考えている。本研究項目を進める上で、トランスポゾンによって転移するマウスを作出することが最も重要であるが、ようやく約50%の頻度で転移するマウスを作出することができた。トランスポゾンによって影響を受ける遺伝子が大腸がんの転移に深く関わることが裏付けられたことから、次年度はそれらの遺伝子群の同定を進める。
以上を総合的に判断して、本研究計画はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.レンチウイルスshRNAライブラリーを用いた転移抑制因子の同定
次年度は、①HNRNPLLの発現制御機構の解明、および②HNRNPLLの発現低下によって生じる遺伝子発現変化あるいはスプライシング変化が大腸がん細胞の浸潤・転移能に与える影響の解明の2項目の研究に注力する。①については、大腸がん細胞のHNRNPLLの発現が上皮間葉転換に伴ってRNAレベルで減少することから、転写調節機構の解明を優先する。最初に5'-RACE法を用いてHNRNPLLの転写開始点の同定をおこない、レポーターアッセイやクロマチン免疫沈降法を用いて転写調節領域の同定および詳細な解析を進める。
②については、HNRNPLL標的遺伝子の強制発現やノックダウンなどの遺伝学的手法と生体内外での浸潤転移能アッセイを駆使してアプローチする。①と②を通して、HNRNPLLが上皮間葉転換およびその逆の変化である間葉上皮転換の中でどのような発現制御を受け、がん細胞の浸潤や転移巣での増殖にどのように寄与しているのか明らかにしたい。
2.トランスポゾンを用いた転移制御因子の同定
次年度は、まずVBAPKPSマウスに生じた肝転移が本当に腸管腺がん細胞由来であるか組織特異的マーカーを用いて検証する。次に、トランスポゾンによって影響を受ける遺伝子の中から転移を制御するものを同定するため、VBAPKPSマウスの肝臓に転移した大腸がん細胞からゲノムDNAを回収し、共通挿入部位CISs（Common Integration Sites）の同定を行う。それぞれのCIS と近傍遺伝子との位置関係、方向性などから、トランスポゾンがその遺伝子を活性化しているか不活化しているか類推する。得られた候補遺伝子について、文献検索、GEO・TCGA・COSMICなどを用いたデータマイニングにより、大腸がんの転移との関連を検討する。
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