2016 Fiscal Year Annual Research Report
Developing the Universal iPS cell lines using genetic engineering system
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26290066
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 健人 東海大学, 医学部, 准教授 (50235363)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / HLA発現低下 / CRISPR/Cas9 / ベータ２m遺伝子 / 移植片拒絶 / NK細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ベータ２m欠損iPS細胞より内皮細胞、網膜色素上皮細胞を分化誘導し免疫原性を検討したところ、NK細胞による攻撃が懸念された。また、未分化iPS細胞に対しては自己T細胞による反応がアロT細胞によるものより大きかった。後者については、成体では発現しない胎児性蛋白が自己MHCに提示されたものをT細胞が認識したものと推測される。前者についてはNK細胞がHLA分子を介した抑制シグナルから解除されたことによると考えられた。現在これらのリスクは試験管内の反応のみで評価せざるをえないが、ヒトT細胞、NK細胞を完全に再現するヒト化マウスの作成が行われれば、より生理的な条件で評価をすることが可能となる。このようなモデル動物を用いた評価系の開発が、今後の展開のために重要な方向性と考える。
CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集は極めて高効率であるが、欠失に成功した細胞の選別は必要である。ベータ2m欠損の場合は全てのHLA classI分子の発現が失われ、pan-HLA class I抗体による染色・フローサイトメーターによる分離で容易であった。しかし、HLA単座欠失細胞の場合、当該アロタイプを認識する優れた抗体が利用できないケースもあり得る。そこで、標的遺伝子部位の相同組換えを起こした細胞を選択し、選択後、不要配列を痕跡なく除去するシステムの開発を行った。これにはPiggyBac(PB)システムを用いた。700-1000bpのarmにpCAG-GFP-(IRES)-PuroRを挿入したコンストラクトを持つPBベクターを作成、CRISPR/Cas9適用時に共存させ、薬剤選択により相同組み換えを起こした細胞を選択。続いてPB transposaseの導入により、痕跡なく不要配列を除去した細胞を得ることができた。さらにマウス受精卵を用いてこのシステムを点突然変異導入に応用する技術を開発し、すでに２遺伝子、複数のアレル導入にも成功した。HLA遺伝子におけるアレル変換が容易に実現可能なことを示せた。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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