2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26290070
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞骨格遺伝子(ベータアクチン遺伝子）や核小体局在遺伝子(フィブリラリン遺伝子）を特異的に切断する人工ヌクレアーゼPlatinum TALENおよびマイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)を利用するためのGFPノックイン用ターゲティングベクターを作製し、ヒト培養細胞（Hek293細胞やHeLa細胞）に導入し、標的遺伝子へノックインが可能かどうかを検討した。その結果、ベータアクチン遺伝子およびフィブリラリン遺伝子座へGFP遺伝子がノックインされ、それぞれの遺伝子産物の局在が観察された細胞を得ることができた。これらの細胞をクローン化し、ノックインできているかどうかを塩基配列レベルの解析によって確認した。その結果、5'の連結部分は正確につながっている一方、3'の連結部分に予期せぬ欠失などの変異の観察されたクローンが見られた。また、これまでノックインで利用されている相同組換え(HR)を利用した方法とMMEJを利用した本方法との効率を比較したところ、MMEJを利用した方法で約2.5倍のノックイン効率の上昇が見られた。これらの結果から、MMEJを介した本遺伝子ノックイン法は培養細胞での簡便かつ効率的な方法であることが示された。
さらに、最近ゲノム編集の主要なツールとして利用されているCRISPR/Cas9を利用して、上記のノックイン法が可能であるかを調べた。その結果、目的の遺伝子座に発現カセットをノックインできることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MMEJを介したゲノム編集によって新規の遺伝子ノックイン法の確立し、その効果を培養細胞において確認することに成功しており、順調に研究が進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞で成功した遺伝子ノックイン法が、動物個体において利用可能であるかどうかを検討し、これまでレポーター遺伝子の導入が困難であった生物種に適用する。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究は順調に進み、平成27年度の個体用いた研究のために使用することが本研究の実績につながると考えたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
遺伝子ノックイン法の個体レベルの適用のための実験試薬、研究補助員の雇用、塩基配列レベルでの解析にH26年度とH27年度の経費を合わせて使用する。
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[Presentation] MMEJ-mediated integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas92015
Author(s)
Nakade S, Tsubota T, Sakane Y, Kume S, Sakamoto N, Obara M, Daimon T, Sezutsu H, Yamamoto T, Sakuma T and Suzuki KI
Organizer
Keystone Sympsia
Place of Presentation
Big Sky, MT, USA
Year and Date
2015-01-11 – 2015-01-16
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