2015 Fiscal Year Annual Research Report
核機能分化に働くテトラヒメナ核膜孔複合体の分子・構造の解明
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26291007
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| Research Institution | National Institute of Information and Communications Technology |
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Principal Investigator |
原口 徳子 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所バイオICT研究室, 主任研究員 (20359079)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 細胞・組織 / 生体分子 / 蛋白質 / 発生・分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
繊毛虫テトラヒメナには、ひとつの細胞内に、大核・小核という構造と機能の異なる２種類の核が存在する。本研究は、核膜孔複合体の分子あるいは構造が、核機能分化に関与する仕組みとその構造的基盤を明らかにするものである。前年度に引き続き、次の２項目の解析を行った。
項目１）大小核の核膜孔複合体を構成する全ヌクレオポリンを同定することで、大小核の核膜孔の構造的な違いを分子レベルで明らかにするのが目的である。本年度は、マススペクトル解析に加え、インシリコの実験を行うことにより、クレオポリンを同定した。インシリコ解析については、その分子構造の特徴（FGリピート、NIFNリピート、WDプロペラ構造、alphaへリックス、betaシート、coiled-coilなど）と、遺伝子発現データベースから得られる遺伝子発現プロファイルから、ヌクレオポリンの特徴を備えた遺伝子を抽出した。可能性が高いものについては、GFP融合タンパク質をテトラヒメナで発現し、その局在から推定した。その結果、昨年の20種類に加えて、新たに６種類のヌクレオポリンの同定に成功した。決定された全ヌクレオポリンの量比を、GFPの蛍光量に基づいて推定し、大小核NPCの構造的な違いを明らかにした。
項目２）受精後の核が大小核へ分化する過程を生細胞イメージングで解析し、核膜孔と核分化との時空間的な関係を明らかにすることが目的である。項目１）で発見された因子が分化に関与する可能性を探るために、受精後の核が大小核へ分化する過程を生細胞イメージング法で解析した。その結果、新規に発見したヌクレオポリンのひとつが、核分化に先立って分化予定核に出現することを見いだした。このヌクレオポリンの、核分化における役割を明らかにするために、遺伝子ノックアウト株の作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
大小核の核膜孔を構成する全てのヌクレオポリン（大小核ともに約30種類程度）を同定するのが目標である。本年度は、マススペクトル解析に加え、インシリコの実験を行うことにより、クレオポリンを同定した。インシリコ解析については、特に、遺伝子発現データベースから得られる遺伝子発現プロファイルの解析が功を奏し、これまで他の方法では発見できなかったヌクレオポリンの抽出に成功した。新たに発見することができたヌクレオポリンは６種類であり、その結果、既知のヌクレオポリンと合わせて、全29種類を同定することができた。これにより、全ヌクレオポリンの同定を達成するという目標を達成した。
受精後の核が大小核へ分化する過程を蛍光イメージング法で解析し、核膜孔と核分化との時空間的な関係を明らかにするのが目的である。既知の大小核に特異的なヌクレオポリンに加えて、新規同定したヌクレオポリンをテトラヒメナ細胞で発現させ、生殖を誘導し、核分化過程を生きた細胞でtime-lapse観察した。この結果、核分化に先立って、特定のヌクレオポリンが分化予定核に局在することが分かった。この結果は、このヌクレオポリンが核分化に重要な働きをしている可能性を示している。このヌクレオポリンについて、遺伝子をノックアウトした細胞株を作製した。
すべての項目で、目標を達成しており、すでに次年度に予定していた成果を挙げていることから予定以上の成果とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画どおりに進行しており、研究計画の変更はない。
ほぼ全てのヌクレオポリンを同定したと考えるが、他にもヌクレオポリンの候補となる分子（あるいは、その遺伝子）が見つかった場合は、そのGFP融合タンパク質をテトラヒメナで発現することにより、その局在から、ヌクレオポリンかどうかを決定する。決定された全ヌクレオポリンの量比を、GFPの蛍光量に基づいて推定し、大小核NPCの構造的な違いを明らかにする。
さらに、これまでに発見されている核輸送タンパク質importinβをベイトに使って、それに結合するヌクレオポリンを、マススペクトル解析で同定する。この解析から特定の核輸送因子に直接結合するヌクレオポリンを同定する。
これらの解析から、核分化に重要と考えられる候補ヌクレオポリンを抽出し、核分化過程での挙動を生きた細胞でtime-lapse解析し、その局在および局在変化から、核分化に関与する可能性を検討する。これらの解析から核分化に重要と考えられるヌクレオポリンに関しては、RNAiによるノックダウンかゲノムDNAの遺伝子破壊を行い、そのタンパク質の核分化に対する役割を調べる。
これらの解析から、核分化に重要な核膜孔構造およびヌクレオポリンを明らかにしたい。
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| Causes of Carryover |
この年度に予定していたプロテオミクス解析が失敗なく順調に進行したために、必要な試薬などの消耗品の使用量を抑えることができた。また生殖過程におけるヌクレオポリンの挙動を蛍光イメージングで解析する研究についても、失敗なく順調にデータが取れたため、予想よりも培養容器や蛍光顕微鏡関連の物品費の使用を抑えることができたため。試薬や容器の購入時に格安のものを利用できたために、消耗品に使う経費を少なくすることができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
遺伝子改変やそれに伴うDNA配列の確認などの遺伝子解析、プロテオミクス解析などの生化学解析、蛍光生細胞観察などに必要な試薬や消耗品、成果を学会発表するための旅費、論文掲載のための論文掲載料、英文校閲費、印刷費などに使用する
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[Presentation] 生細胞イメージング2015
Author(s)
原口徳子
Organizer
第25回細胞生物学ワークショップ
Place of Presentation
情報通信研究機構（兵庫県・神戸市）
Year and Date
2015-07-29 – 2015-07-29
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