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2014 Fiscal Year Annual Research Report

In situ 蛋白質 NMR 構造解析技術

Research Project

Project/Area Number 26291013
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

児嶋 長次郎  大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (50333563)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 藤原 敏道  大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20242381)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsNMR / 蛋白質 / 立体構造 / in situ
Outline of Annual Research Achievements

本研究は生きている細胞で働いている蛋白質を、そのままの状態で立体構造決定する NMR 技術の開発を目的とする。具体的には、生きている細胞で観測したい蛋白質のみを領域選択的かつアミノ酸選択的に安定同位体標識して NMR 信号を帰属する技術や、細胞内で安定な還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いた新規 NMR 測定解析技術を開発し、阪大蛋白研が開発・整備を進めてきた高磁場 DNP 法など世界最先端の NMR 技術・装置と組み合わせることで、生きている細胞のままで蛋白質の立体構造を決定する技術を確立することを目指している。
平成26年度は、(1)目的蛋白質の領域選択的かつアミノ酸選択的な安定同位体標識技術を開発した。具体的には、目的「外」蛋白質の翻訳を完全に阻害できる SPP システム(配列特異的な RNA 切断酵素を共発現させる低温発現系)を用い、目的「外」蛋白質の標識を完全に抑制する技術の開発に成功した。また、SPP システムとアミノ酸要求性株とを組み合わせ、大腸菌の系でアミノ酸選択的な標識技術の開発に成功した。さらに、(2)還元耐性スピンラベル試薬およびキレート試薬を用いた NMR 測定解析技術を開発した。具体的には、細胞内で利用可能な還元耐性を持つスピンラベル試薬を用い、マレイミド基を介して不可逆的にスピンラベルをシステインに導入し、常磁性緩和促進(PRE)法によって立体構造情報を得ることに成功した。また、目的蛋白質の N 末端選択的に還元耐性を持つキレート試薬を導入し、キレート試薬とランタニド金属を用いた偽コンタクトシフト(PCS)法によって立体構造情報を得ることに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は平成26年度より平成28年度まで実施する。平成26年度は計画どおり研究が進捗し、平成26年度に計画していた研究目的は概ね達成できた。

Strategy for Future Research Activity

本研究は平成26年度より平成28年度まで実施する。平成26年度は計画どおり研究が進捗したため、平成27年度は当初の計画どおり研究を進める。

Causes of Carryover

適任者が見つからず、研究補助員が雇用できなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究補助員の雇用に充てる。

  • Research Products

    (5 results)

All 2015 2014

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Acknowledgement Compliant: 4 results) Presentation (1 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Utilization of paramagnetic relaxation enhancements for high-resolution NMR structure determination of a soluble loop-rich protein with sparse NOE distance restraints2015

    • Author(s)
      Kyoko Furuita, Saori Kataoka, Toshihiko Sugiki, Yoshikazu Hattori, Naohiro Kobayashi, Takahisa Ikegami, Kazuhiro Shiozaki, Toshimichi Fujiwara and Chojiro Kojima
    • Journal Title

      J. Biomol. NMR

      Volume: 61 Pages: 55-64

    • DOI

      10.1007/s10858-014-9882-7

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] The crystal structure of the plant small GTPase OsRac1 reveals its mode of binding to NADPH oxidase2014

    • Author(s)
      Ken-ichi Kosami, Izuru Ohki, Minoru Nagano, Kyoko Furuita, Toshihiko Sugiki, Yoji Kawano, Tsutomu Kawasaki, Toshimichi Fujiwara, Atsushi Nakagawa, Ko Shimamoto and Chojiro Kojima
    • Journal Title

      J. Biol. Chem.

      Volume: 289 Pages: 28569-28578

    • DOI

      10.1074/jbc.M114.603282

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Bacterial effector modulation of host E3 ligase activity suppresses PAMP-triggered immunity in rice2014

    • Author(s)
      Kazuya Ishikawa, Koji Yamaguchi, Kazuaki Sakamoto, Satomi Yoshimura, Kento Inoue, Seiji Tsuge, Chojiro Kojima and Tsutomu Kawasaki
    • Journal Title

      Nature Commun.

      Volume: 5 Pages: 5430

    • DOI

      10.1038/ncomms6430

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Latest approaches for efficient protein production in drug discovery2014

    • Author(s)
      Toshihiko Sugiki, Toshimichi Fujiwara and Chojiro Kojima
    • Journal Title

      Expert Opin. Drug Discov.

      Volume: 9 Pages: 1189-1204

    • DOI

      10.1517/17460441.2014.941801

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] Paramagnetic NMR utilized for high-resolution protein structure determination2014

    • Author(s)
      Chojiro Kojima
    • Organizer
      The 5th Japan-Taiwan bilateral NMR symposium
    • Place of Presentation
      Hokkaido University (Sapporo)
    • Year and Date
      2014-09-29 – 2014-09-30
    • Invited

URL: 

Published: 2016-06-01  

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