2017 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of substrate recognition mechanism of I-CLiP in the trans- and juxta-membrane regions
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26291016
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
禾 晃和 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (40379102)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / シグナル伝達 / 酵素 / 膜蛋白質 / 立体構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までの研究では、２つの生物種由来の標的膜タンパク質について結晶化を行ってきたが、本年度はさらにもう１つの生物種由来のホモログを取り上げ、発現と結晶化に取り組んだ。試料調製では、通常末端に融合するタグ配列をタンパク質に内部に挿入することで精製スキームの簡略化を図った。また、このタグ挿入タンパク質については、抗体断片との結晶化も行なった。昨年度の研究において、抗体断片との複合体で結晶の得られていたコンストラクトについては、結晶の再現性の向上を目指しタグの挿入部位の最適化を行った。その結果、タグ挿入部位を変化させたコンストラクトについても同様に抗体断片との複合体の結晶が得られた。また、本年度研究に取り組んだ３種の膜タンパク質のうち、上記のものとは別の１種については、これまでの研究から単独状態で結晶が得られることが分かっていた。このタンパク質について可溶化に用いる界面活性剤の検討などを行い結晶性の改善を試みたところ、分解能の有意な向上が見られた。さらに本年度は、標的膜タンパク質の可溶性領域の部分断片を用いることでタグ配列の挿入方法の検討を行なった。具体的には、部分断片にタグ配列を挿入した変異体タンパク質を発現させ、抗体断片との複合体のX線結晶構造を解析することで、タグ挿入による標的タンパク質の構造変化などを詳細に調べた。その結果、適切に挿入部位を設計することで、標的タンパク質の構造を安定に保つことが可能であることが明らかになった。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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