2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26291018
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
太田 邦史 東京大学, 総合文化研究科, 教授 (90211789)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坪井 貴司 東京大学, 総合文化研究科, 准教授 (80415231)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ノンコーディングRNA / lncRNA / クロマチン / 転写制御 / ストレス応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノムの大半を占める非コード領域から、長鎖非コードRNA(lncRNA)が多数合成されるが、大半の機能は不明である。本研究では、申請者らが見出した代謝ストレス応答性lncRNA(mlonRNA)、および付随するアンチセンスRNA(asRNA)の機能を解析した。
①RNA合成阻害剤や上流域の配列置換株などを用いてmlonRNAの転写を阻害すると、プロモーター上流域への転写活性化因子Atf1の結合が大幅に低下した。また、Atf1の結合阻害はmlonRNAのカスケード転写を阻害した。以上の結果から、mlonRNA転写とAtf1結合間にポジティブ・フィードバック制御が存在するが示された。また、グルコース豊富時にfbp1領域でmlonRNAと相反的に合成されるアンチセンスlncRNAの機能を解析した。今回、誘導的プロモーターをこれらlncRNA上流に配置し条件発現制御系を構築した。その結果、mlonRNAを発現するとasRNAの転写が抑制され、asRNAを誘導発現するとセンス鎖RNAの合成が抑制された。
②mlonRNAの過半が細胞質に移行してリボソームに結合して徐々に分解される。fbp1上流域に高密度で存在するuORFのATGを全てACGに変換した株では、mlonRNAが著しく安定性した。この結果は、mlonRNA にNo-Go分解経路(NGD)が作動する可能性を示唆するため、NGD類縁遺伝子の変異体を解析したが、その関与は否定された。また、各種変異体を用いて半減期の測定を行い、これらlncRNAの分解経路を明らかにした。
③ヒト膵臓β細胞株MIN6を低グルコース・高グルコース培地で培養し、グルコース濃度に依存して合成される遺伝子の抽出を行った。
④ヒトMIN6細胞でエキソサイト―シスを誘発し、放出されるエキソソームを単離した。エキソソーム画分に低分子のncRNAが存在することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分裂酵母を用いたmlonRNA／asRNAの解析は予想以上に進展している部分がある。ヒト細胞の解析は一部実験が遅れていたが、現在はその遅れを取り戻している。
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度に関しては、おおむね予定通りの計画を実施する。分裂酵母lncRNAについては特にエピジェネティック修飾の制御について解析を行う。特にヒストンアセチル化との関係を解析する。アンチセンスRNAについては、分裂酵母のグルコース飢餓状態の段階に、あらたにグルコースを添加した実験を行い、その役割を解析する。とくに、センス鎖とアンチセンス鎖が共存する状況下で、RNAの安定性にどのような変化があるかを明らかにしていく。また、RNA FISH法やSmartFlare法などで1細胞レベルでlncRNAの視覚化を行う実験を予定している。エキソソーム中のlncRNAについては存在量が限定的であることがわかってきたため、継続して研究するか、この段階で研究を中止するかについて検討を行う。
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| Causes of Carryover |
平成27年度に大量の次世代シーケンサーとマイクロアレイを用いた解析が予定されており、その分の予算を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成２７年度に酵母及びヒト細胞のlncRNAのRNA-seqを10資料分、アレイ解析を10資料分実施する。また、lncRNAによって制御される分裂酵母のエピゲノム解析のために、ChIP-seqを7資料分ほど実施する。
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