2014 Fiscal Year Annual Research Report
細胞分裂過程とリンクした標的分子の網羅的マッピング法の開発
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26291028
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岩根 敦子 大阪大学, 生命機能研究科, 招へい教授 (30252638)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 朋信 大阪大学, 免疫学フロンティアセンター, 招へい准教授 (00375205)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | FIB-SEM / 超微細構造 / 細胞分裂 / シゾン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電子顕微鏡観察は標的分子並びに細胞小器官だけでは無く、それを取り囲む環境を含めた超微細構造として可視化出来る利点がある。クライオ電子顕微鏡観察は化学固定すること無く、無染色で真の構造が観察出来る期待が持たれるが、TEM 観察故、その分解能は試料の厚さに制限がある。そこで、空間分解能が理論的には試料の厚さに影響を与えないFIB-SEM を用いて最小限度の細胞小器官を有するシゾンを生命の基本である細胞分裂過程のモデル生物として選び、電子顕微鏡観察で苦手であった標的分子の同定を網羅的複数同時にマッピングしながら細胞丸ごとレベルで超微細構造解析を行う。
平成26年度は
先ず、シゾンの細胞分裂の母集団を保てるように光の明暗並びに二酸化炭素の培養液への添加の有無を調整する事で同調培養系の確立に挑戦し、８割以上の細胞の同調化に成功した。次に電子顕微鏡観察としては固定方法や染色方法など試料作製を工夫しながら、FIB-SEMに加え、超高圧TEMトモグラフィーを用い,それぞれの特性を活かしながら超微細構造解析する開発を行った。超高圧TEMトモグラフィーにより、TEM観察の分解能を十二分に活用したく、あえて0.5ミクロン程度の切片の観察を行った。FIB-SEMではその観察が多少難しい色素体内部のチラコイド膜上のフィコビリソーム複合体やミトコンドリア内部構造をはっきりと観察出来るようになった。FIB-SEMによりシゾン丸ごとをオルガネラの形状を、オルガネラ内部の超微細構造は超高圧TEMトモグラフィーで補填をしたいと考えている。しかし、蛍光顕微鏡のGFPに相当すると期待される新たな組換え体改良タグ(miniSOG 誘導体やAPEX誘導体)の開発はシゾン内のペルオキシダーゼ活性が余りにも高く、一般的な動物細胞では可能である事が確認されたものの残念ながら現時点ではシゾンでは分子同定には使い難いと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
電顕試料として母集団を保てる同調培養系の確立は予想以上に順調に進んだと思う。電子顕微鏡観察に先立ち、光学顕微鏡で同調培養下でのオルガネラの位置を確認するために市販のオルガネラ特異的識別蛍光試薬をいくつか試したが、同一細胞での分裂に伴うオルガネラの動的な変化は観察する事は出来なかった。それはシゾンの培養液はPH約2.5程度であることに起因すると思われる。培養ステージの確認は適切な化学固定-溶液交換後の試料でのみ、Hoechst33342染色された DNAと色素体の自家蛍光でのみ行ったが、大まかなステージ分類するだけであれば今のところ十分だと考えている。電子顕微鏡観察で苦手であった標的分子の同定のための組み換え体の発現系は一過性発現と相同性組み換えによるゲノムターゲット発現の両方の立ち上げを試み系の確立に成功した。汎用性のある動物細胞での発現系と比べ、発現系の確立に少し時間がかかったが、想定の範囲であったと考える。顕微鏡観察は申請時からのFIB-SEMに加え、超高圧TEMトモグラフィー技術を用いるとFIB-SEMを用いた細胞丸ごとレベルの構造解析にさらに局所的に補填出来る事が解り、これも嬉しい成果である。しかし、当初、電顕-光顕両方での標的分子のマーカーになると期待していたminiSOGタグやその関連蛋白質であるAPEXタグは一般的な動物細胞では可能である事を確認した。これらのタグは動物細胞ではマッピングのための使用可能なマーカーになると考えられるが、一方、シゾンでは主要なオルガネラの一つであるペルオキシダーゼの活性が余りにも高く、残念ながら現時点ではシゾンでは断念せざるおえないことが解った事が目的達成度の減点項目であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
超微細構造は観察出来るものの、細胞の重要な役割とリンクした細胞内の超微細構造において電子顕微鏡観察の苦手な点としては①リアルタイムでの動的な構造変化や②標的分子の同定、この2点が挙げられる。動的な変化に関しては超高分解能光学顕微鏡観察で対応する予定であったが、培養液のPH問題があり、同一細胞内の変化を追うことは難しそうであるので、物足りなさは感じるが、現時点では固定後の超高分解能光学顕微鏡観察で進める予定である。2番目の項目については電子顕微鏡のマーカーとなりうるタグを開発し、真核生物の最小限度の細胞小器官を有し、既に全ゲノムが解明されている生物であるシゾンの細胞分裂に寄与する複数の標的分子を同時に、そして網羅的マッピングするための系の開発を行う予定である。また、標的分子の存在場所のみならず、取り囲む環境の動きを踏まえながら生物丸ごとレベルで可視化し、生物の生存に必須である “均一に確実に娘細胞に分裂する細胞小器官の振る舞い”を解明するのが本課題の目的であり、目標である。同調培養、試料作製並びに電子顕微鏡観察は順調に開発が進んでおり、また、構造モデルを可視化する系も準備が整いつつある。少し出遅れている電子顕微鏡観察において多少、苦手とされる分子の同定をも可能とするタグはminiSOG, APEXに留まらず、別の組換え体の開発を早急に進めて行く予定である。
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| Causes of Carryover |
旅費で計上していた予算が3viewの装置故障のため一部使用されなかったため旅費の予算は新たに必要になった物品費に回したが、残金が一部生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度繰越金として159,938円は物品費に加えたい
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