2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26292045
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
藤原 伸介 関西学院大学, 理工学部, 教授 (90263219)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
跡見 晴幸 京都大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90243047)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アーキア / ヘリカーゼ / ポリアミン / 低温適応 / 好熱菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Thermococcus kodakarensisの低温誘導性遺伝子には、リボソーム結合部位から開始コドンまでに、アデニンまたはチミンの連続配列に富む領域が保存されていた。低温誘導型RNAヘリカーゼTK0306遺伝子において、培養温度の違いによるmRNA長の変化を検証した。高温（85℃以上）で特異的にmRNA長が短くなっており、温度依存的なpremature terminationが起きていることが明らかになった。また低温誘導型ヘリカーゼTK0306の性質を、構成的発現を示すヘリカーゼTK0566と比較した。TK0306は一本鎖分子がつくる二本鎖部分のみ作用したのに対し、TK0566は3’-突出の二本鎖DNA部分に作用することが示された。T. kodakarensisは生育温度の下降に伴い、分岐鎖ポリアミンであるN4-ビスアミノプロピルスペルミジン[3(3)(3)4]の割合が減少し、スペルミジン[34]の割合が高まる。そこで3(3)(3)4生合成系の各遺伝子の発現動態解析を行い、転写量から生合成の温度依存性を推測した。その結果3(3)(3)4合成系遺伝子に温度依存性は無く、S-アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子に温度依存性がみられた。ポリアミン成分の温度変化は生合成系遺伝子の発現量変化では無く、反応基質の量により変化していると考えられる。また、チアミン、モリブドプテリン、鉄硫黄クラスターなどの含硫補因子はあらゆる生物の生命維持に寄与しているが、L-システインの硫黄原子を脱離する反応を触媒するシステインデスルフラーゼ（CDS）は、本菌において不明であり、硫黄が関与する呼吸様式とその温度依存性も明らかではなかった。今回、CDSオルソログの酵素学的解析と遺伝子破壊実験を行ったところ、本菌がCDSを獲得した事で環境中の元素硫黄の要求性から脱し、それが水素発生型呼吸など代謝の多様化を促したと考えられた。ただし本遺伝子に顕著な温度依存性はみられなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画していた研究項目のうち、低温誘導遺伝子の精密プロファイリング、および誘導遺伝子の機能予測と誘導機構の解明は順調に進んだ。特に低温誘導が高温特異的な転写終結によってなされることを明らかにできたことには満足している。また、低温誘導型シャペロンの機能解析は現在、実験系の準備段階であり、次年度以降に詳細な解析がなされると思っている。ポリアミンの組成変動メカニズムについて、生合成系遺伝子の発現を解析できたのは有意義であったが、酵素の性質に注目した生化学的な解析が必要と考えている。酵素の精製を行う際に必要な冷却遠心機が故障し、実験遂行の遅延を招いた。次年度に新機器を購入し、研究環境を整えたい。今年度に得られたシステインデスルフラーゼに関する研究は、温度依存性に関する知見にはならなかったが、鉄硫黄クラスターの進化を考える上で、新たな展開に繋がる成果になったと思っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究体制を強化するため、秀瀬涼太助教を連携研究者に加える。また、予算執行と同時に緊急性の高い大型冷却遠心機を購入する。昨年、交換できなかったHPLCポンプも購入し換装する。このため予算申請時に予定していた新たな嫌気ボックス導入をしばらく見合わせる。研究内容としてあげている「低温誘導遺伝子の精密プロファイリング」及び「誘導機構の解明」を継続して行う。特にヘリカーゼについては温度特性の異なる酵素を生化学的に比較解析し、低温ストレス下での関与を酵素レベルでの考察を試みる。また前年度に解析が終了していなかった「低温誘導型シャペロンの機能解析」は平成27年度に重点項目に位置づけ、精力的に研究する。特により低温で機能する分子シャペロニンが構築できた場合、その変異を導入したThermococcus kodakarensisを作成し、生育特性を検証したい。「ポリアミンの組成変動メカニズム」は酵素の反応速度論的解析を様々な反応温度で行い、酵素レベルでの制御の可能性を調べたい。
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| Causes of Carryover |
平成26年末に大型冷却遠心機が故障し、導入が必要となったため、平成27年度に新しい大型冷却遠心機の購入を計画した。高額の機器であるため、平成26年度の購入物品を抑えた。敢えて繰越金（次年度使用額）を残し、平成27年度物品費と合算することで大型冷却遠心機の購入を計画した。平成26年度は消耗品費を節約するとともに、予定していたHPLC用ポンプの換装を諦めた。また、研究打ち合わせの回数を減らし、海外での学会発表も見送った。これらの方策により平成27年度に大型冷却遠心機を購入する目処がついた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
部品の購入に大部分の予算を充てる。予算執行後、ただちに大型冷却遠心機を購入し、研究遂行の円滑化をはかる。またHPLCのポンプを換装し、ポリアミン分析の効率化を行う。前年度からの繰越金と合算することでこれら機器の導入が実現する。平成27年度は、これまでに蓄積されている成果を国内外の学会で発表すると共に、学術論文としても発表したい。平成27年度は旅費と論文作成にかかる費用を増額した。
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[Book] Protein synthesis and polyamines in thermophiles: Effect of polyamines on nucleic acid maintenance and gene expression. In T. Kusano and H.Suzuki (ed.), Polyamines, a universal molecular nexus for growth, survival and specialised metabolism2014
Author(s)
Fujiwara,S., Hidese, R., Inoue,T., Fukuda, W.
Total Pages
336(143-152)
Publisher
Springer Co.Ltd., New York
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