CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集によるPRRS抵抗性ブタの開発

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26292151
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小野 悦郎 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00160903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河原崎 達雄 東海大学, 農学部, 教授 (70500247)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 豚繁殖・呼吸障害症候群 / ゲノム編集 / 抗病性動物 / PRRS

Outline of Annual Research Achievements

豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は、口蹄疫、高病原性鳥インフルエンザ等と同様に多様な抗原性を示すウイルスによる感染症であり、ワクチンプログラムで本病を制御することは極めて困難である。そのような感染症の新たな制圧方法として、本研究課題では、CRISPR/Cas9システムを利用して、PRRSウイルスのレセプター分子であるCD163及びSiglec1遺伝子をゲノム編集し、PRRSウイルス感染抵抗性ブタを開発することを目的として、以下の実験を実施した。
１）PRRSウイルス感受性のサル腎臓上皮由来細胞である株化細胞株MARC-145のPRRSウイルスレセプター分子として報告されているCD163の遺伝子をCRISPR/Cas9システムを利用してゲノム編集することで、CD163分子の発現を阻害し、PRRSウイルス感染抵抗性細胞の樹立を試みたが、これまでのところ成功していない。
２）CD163およびSiglec1のゲノム編集用プラスミドを構築した。
３）家畜ブタの卵巣から未受精卵子を取り出し、培養することで成熟させた後、体外受精により得た受精卵の前核にゲノム編集用プラスミドを常法に従いマイクロインジェクションし、胚盤胞まで培養した。合計80個の胚盤胞からDNAを抽出し、PCRで目的のDNA断片を増幅し、ゲノム編集の有無について解析中である。
４）3匹の排卵誘発した雌家畜ブタに人工授精して得られた約50個の受精卵の前核にCD163ゲノム編集用プラスミドを常法に従いマイクロインジェクションし、約30個の受精卵を1匹の仮親家畜ブタの卵管に移植し、6匹の産仔を得た。現在、ゲノム編集の有無について解析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

家畜ブタからの受精卵の採取条件の検討に時間を要し、昨秋の発情期において、ゲノム編集用インジェクションを1回しか実施できず、平成26年3月に6頭の産仔を得たが、現在解析中であり当初の計画よりもやや遅れていると自己評価した。

Strategy for Future Research Activity

１）引続きゲノム編集用プラスミドのインジェクションを継続する（平成27年度1回目を平成27年4月に実施済）。
２）CD163およびSiglec1の2つのゲノム編集用プラスミドの同時インジェクションについて検討する。
３）ゲノム編集用プラスミドに代わり、sgRNAおよびCas9 mRNAの細胞質へのインジェクションについて検討する。

Causes of Carryover

家畜ブタからの受精卵の採取条件の検討に時間を要し、昨秋の発情期において、ゲノム編集用インジェクションを1回しか実施できず、平成27年度にゲノム編集用インジェクションを集中して実施するために、次年度使用額とした。

Expenditure Plan for Carryover Budget

家畜ブタの発情期の春秋にゲノム編集用インジェクションを集中して計画しており、採卵用ブタ、仮親ブタ及び飼料の購入に使用する予定である。