Generation of PRRS-resistant pigs using CRISPR/Cas9 system

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26292151
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小野 悦郎 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (00160903)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河原崎 達雄 東海大学, 農学部, 教授 (70500247) ; 柴田 昌利 静岡県畜産技術研究所, その他部局等, その他 (70501443)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 豚繁殖・呼吸障害症候群 / ゲノム編集 / 抗病性動物 / PRRS

Outline of Annual Research Achievements

豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は、口蹄疫、高病原性鳥インフルエンザ等と同様に多様な抗原性を示すウイルスによる感染症であり、ワクチンプログラムで本病を制御することは極めて困難である。そのような感染症の新たな制圧方法として、遺伝子改変技術による抗病性動物の開発が提唱されて久しいが、未だ家畜での成功例は報告されていない。本研究課題では、PRRS抵抗性ブタの開発を目的に、次世代遺伝子改変技術であるCRISPR/Cas9システムを利用して、PRRSウイルスのレセプター分子であるCD163及びSiglec1遺伝子をゲノム編集し、PRRSウイルス感染抵抗性ブタを開発することを目的として、以下の実験を実施した。
1)CD163及びSiglec1に対するゲノム編集用合成sgRNA２種類とCas9 蛋白の細胞質へのインジェクションによるゲノム編集操作を１回実施した。２頭の仮親ブタに、各々90個の胚を移植し、各々７頭及び4頭の産仔が得られた。計11頭の産仔について、皮膚からDNAを抽出し、塩基配列の解析を実施したところ、１頭でSiglec1遺伝子に1個のadenineのinsertionが確認された。他の部位の皮膚についても塩基配列の解析を実施したが、ゲノム編集は認められなかった。このことから、当該ブタのゲノム編集はモザイク状態であることが示唆された。
2)マイクロミニピッグ由来の線維芽細胞及び間葉系幹細胞細胞にCD163遺伝子ゲノム編集用プラスミド（pX459）をトランスフェクションし、puromycineで選択することで、１塩基deletion及び1塩基insertionされたゲノム編集細胞を樹立した。
3)2)で樹立したCD163遺伝子をゲノム編集したマイクロミニピッグ由来の線維芽細胞と未受精卵との細胞融合により、体細胞クローン胚を作製し、仮親ブタに34個の胚を移植し、現在出産待ちである。

Research Progress Status

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Causes of Carryover

28年度が最終年度であるため、記入しない。

Expenditure Plan for Carryover Budget

28年度が最終年度であるため、記入しない。