2016 Fiscal Year Annual Research Report
細胞膜マイクロドメインを介した植物環境ストレス応答機構の解明
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26292190
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
川合 真紀 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10332595)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | スフィンゴ脂質 / ストレス応答 / イネ / シロイヌナズナ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は外的なストレスに関して、細胞膜上のマイクロドメインを介してシグナル伝達を行い、様々な応答反応を行っていると考えられる。本研究では、高発現すると酸化ストレス耐性を植物細胞に付与するBI-1(Bax Inhibitor-1)遺伝子の解析に端を発し、これまでに小胞体膜上のスフィンゴ脂質生合成関連酵素群を介した細胞応答機構の解明を行ってきた。BI-1と物理的、あるいは機能的な相互作用因子としてFAH、ELO、SLDに注目し、これらの発現量を変えたイネ及びシロイヌナズナを作出し、これらの植物体における脂質分析と酸化ストレス耐性に注目した研究を推進している。本年度の主要な成果として、イネ及びシロイヌナズナのFAH(fatty acid hydroxylase)高発現体の作出がある。これまでにFAHノックダウン系統では2-ヒドロキシスフィンゴ脂質が減少し、イネではいもち病抵抗性が低下することが示されている。得られたシロイヌナズナFAH1およびFAH2高発現体の脂質分析をLC-MS/MSにより行った結果、これらの系統では2-ヒドロキシスフィンゴ脂質の割合が増加していることが分かった。シュードモナス菌（AvrRPT2）を感染させ、イオン漏出量を測定した結果、これらの系統ではより多くイオンが漏出しており、抵抗性反応としての過敏感細胞死がより強く誘発されている可能性が示された。加えて、これまでFAH1のT-DNA挿入株が存在しない為に最終的な結論が出せないでいたシロイヌナズナFAHの完全破壊株について、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集技術によりFAH1変異体の作出を試みた。現在、得られたゲノム編集株をFAH2変異体と交配し、２重欠損系統の作出を行っている。この系統が確立されることにより、2-ヒドロキシスフィンゴ脂質の生理機能について飛躍的に理解が進むと期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
スフィンゴ脂質生合成関連酵素の発現量を変えた植物系統（高発現系統、破壊系統等）が順調に作出されており、脂質組成の解析及び表現型解析が進んでいる。特に、FAHを高発現させたシロイヌナズナ系統では、シュードモナス菌（AvrRPT2）に対する過敏感細胞死が増加している可能性が示され、2-ヒドロキシスフィンゴ脂質の割合を増加させる事により、病害抵抗性を高める事ができる可能性が示された。また、LC-MS/MSを用いた高効率なリピドミクスの研究手法を確立し、この成果をPlant Journal誌にTechnical Advancesとして掲載することができた。さらに、イネのFAH欠損系統を用いたいもち病に対する病害抵抗性の分子機構に関する研究成果を Plant Cell 誌に報告することができ、これまでの研究成果を国際的に評価が高い学術誌に報告する事ができた。これら２件についてはプレスリリースも行った。順調に研究は進んでおり、学会等での研究報告等も順調におこなうことができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究材料の作出はほぼ終了し、これらの植物系統の解析が現在の主要な研究内容となっている。どのように効率的に様々な分子種を含むスフィンゴ脂質を定量するかが一つの大きな課題であったが、これについては、LC-MS/MSによるリプドミクス手法の開発を行った事により可能となった（Ishikawa et al., 2016）。今後、この手法により作出した植物系統の評価を行っていくこととなる。一方、マイクロドメインの抽出および評価については、現在でも課題が多い。マイクロドメインの定義が研究分野としても確実には定まっておらず、厳密なマイクロドメインの抽出は不可能に近い。現在では、DRM(detergent resistant membrane)として界面活性剤に可溶化されにくい画分をマイクロドメインを含む画分として使用せざるを得ない状況である。DRMとマイクロドメインが同一でないことはDRMタンパク質の局在とマイクロドメインタンパク質の局在が必ずしも一致しないことがイメージング手法を用いた解析等からも示されている。今後、スフィンゴ脂質の量や質を改変した植物系統におけるマイクロドメインタンパク質の動態を詳細に解析する上で、これらの点については十分に配慮をする必要がある。また、膜の流動性を議論するための実験手法についても今後導入が必要であり、検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
代謝物測定の為の装置類（LC-MS/MS、CE-MS/MS）のメインテナンスと、解析再開に伴う条件の再設定などで予定よりを時間を要し、測定スケジュールが後ろへずれたため、次年度使用額が生じている。また、当初、今年度に予定していた脂質抽出に使用する機器類（減圧遠心機等）のセットアップを研究の進み具合から判断して来年にずらす事にした。これらの理由により、次年度使用額が生じたものである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
代謝物測定のうち、来年度にずれた試料の測定の為の経費（消耗品の購入）、脂質抽出系のセットアップの為の消耗品類の購入等により、次年度予算と合わせて支出予定である。
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Research Products
(20 results)
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[Journal Article] Loss of inositol phosphorylceramide sphingolipid mannosylation induces plant immune responses and reduces cellulose content in Arabidopsis2016
Author(s)
Fang L, Ishikawa T, Rennie EA, Murawska GM, Lao J, Yan J, Tsai AY, Baidoo EE, Xu J, Keasling JD, Demura T, Kawai-Yamada M, Scheller HV, Mortimer JC
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Journal Title
Plant Cell
Volume: 28
Pages: 2991-3004
DOI
Int'l Joint Research
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[Presentation] 組織特異的なクチクラ形成制御に基づいた種子の改変2017
Author(s)
Oshima Y, Narumi T, Kaneko Y, Ishikawa T, Kawai-Yamada M, Ohme-Takagi M, Mitsuda N
Organizer
植物生理学会
Place of Presentation
鹿児島大学（鹿児島県、鹿児島市）
Year and Date
2017-03-16 – 2017-03-18
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