2014 Fiscal Year Annual Research Report
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26293100
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
水之江 義充 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (20157514)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉本 真也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60464393)
田嶌 亜紀子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70317973)
奥田 賢一 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (70624245)
岩瀬 忠行 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (80385294)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / 黄色ブドウ球菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）MR23株に多量に発現しているEap（extracellular adherence protein）のバイオフィルム形成メカニズムの解析を試みた。精製したEapをバイオフィルム低形成株に添加するとバイオフィルム形成を増強した。そこで、MR23株のEap欠損株を作成したが、バイオフィルム形成はほとんど影響を受けなかった。そこで細胞壁にタンパク質を共有結合させるsortese A（srtA）との二重欠損株を作成したところ著しくバイオフィルム形成阻害を認めた。このことからEapは他のタンパク質と共同してバイオフィルム形成を増強していると考えられた。
黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成を経時的に定量すると、数時間でバイオフィルム形成が最高に達し、その後減少することを見いだした。そこで、バイオフィルムの培養上清中に破壊因子が発現してくると考えた。既に形成したバイオフィルムに一晩培養したバイオフィルム上清を添加すると、バイオフィルムが破壊されることが判明した。培養上清を画分すると、10～50kDaと100kDa以上の画分にバイオフィルム破壊活性があることを見いだした。
東京大学創薬オープンイノベーションセンターとの連携により、バイオフィルム形成を阻害する化合物のスクリーニングを行うため、分注ロボットと多穴プレートを用いたハイスループットスクリーニングシステムを構築した。黄色ブドウ球菌実験室株SH1000（MSSA：メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）と臨床分離株MR23（MRSA）のバイオフィルムをターゲットとして、約60,000化合物のスクリーニングを行った。SH1000株のバイオフィルム形成阻害化合物15個、MR23株のバイオフィルム形成阻害化合物6個を取得した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
表皮ブドウ球菌が分泌するバイオフィルム破壊酵素（Esp）の標的タンパク質は約70種類みとめられるが、MRSAに多量に発現しているEapの役割を検討した。ブレビバチルスのタンパク質大量発現系を用い、Eapを精製した。精製したEapは、バイオフィルム低形成の黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成を増強した。Eap単独欠損株はバイオフィルム形成に影響を与えず、Eap, srtA二重欠損株を作製し、Eapと他の細胞壁タンパク質が共同してバイオフィルム形成に関与している可能性を見いだした。
バイオフィルム培養上清にバイオフィルム破壊作用があることを見いだした。上清をカラムにて画分し、バイオフィルム破壊活性は10～50kDaと100kDa以上の画分に存在することが判明した。
黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成阻害剤の大量スクリーニングを行い、21個の化合物を取得した。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞壁にタンパク質を共有結合させる膜タンパク質であるsrtAは、グラム陽性菌に存在する二十数種のタンパク質を細胞壁に局在化させることができる。これらのタンパク質のいずれかとEapが相互作用することでバイオフィルム形成を増強すると考えられる。細胞壁タンパク質の欠損ライブラリーを作成し、Eapとの相互作用を解明する。
黄色ブドウ球菌のバイオフィルム上清に存在するバイオフィルム破壊活性画分より破壊因子の精製と破壊メカニズムの解明を試みる。
ハイスループットスクリーニングで獲得したバイオフィルム阻害化合物の作用メカニズムを解明するため、化合物の阻害最適濃度などの条件を検討し、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムマトリクスに与える影響や黄色ブドウ球菌の遺伝子発現に与える影響について検討する。
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| Causes of Carryover |
消耗品が予算よりも安く購入でき、また、旅費も予算には計上していたが科研費からは支出しなかったため、平成26年度予算において一部が未使用となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究費は、バイオフィルムの形成メカニズムの解明、黄色ブドウ球菌の分泌するバイオフィルム破壊因子の単離、バイオフィルムの阻害や破壊活性を有する化合物の作用メカニズムを解明するための試薬・器具の購入費および解析費用、国内外における研究成果の発表のための費用として使用する予定である。
また、論文投稿や別刷りのための費用としても使用したいと考えている。
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Research Products
(14 results)
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[Journal Article] Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.2014
Author(s)
Kinoshita T, Mori Y, Hirano K, Sugimoto S, Okuda K, Matsumoto S, Namiki T, Ebihara T, Kawata M, Nishiyama H, Sato M, Suga M, Higashiyama K, Sonomoto K, Mizunoe Y, Nishihara S, Sato C.
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Journal Title
Microsc Microanal
Volume: 20
Pages: 470-484
DOI
Peer Reviewed
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