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2015 Fiscal Year Annual Research Report

バイオフィルム形成機構に立脚した阻害法の開発

Research Project

Project/Area Number 26293100
Research InstitutionJikei University School of Medicine

Principal Investigator

水之江 義充  東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (20157514)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 杉本 真也  東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60464393)
田嶌 亜紀子  東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70317973)
奥田 賢一  東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70624245)
岩瀬 忠行  東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (80385294)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2018-03-31
Keywordsバイオフィルム / 黄色ブドウ球菌
Outline of Annual Research Achievements

黄色ブドウ球菌の細胞外分泌タンパク質Extracellular adherence protein (Eap)は、バイオフィルム形成を促進した。臨床分離株のEap単独欠損株を作製したが、バイオフィルムの形成は低下しなかった。このことよりEapは他のタンパク質との相補的に機能し、バイオフィルム形成に関与していると考え、細胞壁にタンパク質を共有結合させる膜タンパク質であるsortase A(srtA)との二重欠損株としたところ、著しいバイオフィルム形成の低下を認めた。
srtAはグラム陽性菌に存在する20数種の特徴的なmotifをもつタンパク質を細胞壁に局在化できるため、これらのタンパク質のいずれかとEapが相補的に機能することでバイオフィルム形成に関与していると考えられた。そこで、細胞壁タンパク質の欠損株ライブラリーを作製した。その結果、EapとSasGの二重欠損株で著しくバイオフィルム形成が低下することを見いだした。
黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の経時的変化を解析したところ、バイオフィルム形成後に崩壊がみられ、この崩壊メカニズムの解明を試みた。バイオフィルムの細胞外マトリクス解析から、バイオフィルム崩壊に伴いマトリクス中の核酸の分解がみられた。崩壊したバイオフィルム上清中にはヌクレアーゼ活性がみられ、ヌクレアーゼの添加によりバイオフィルムは崩壊した。以上より菌が産生するヌクレアーゼがバイオフィルムマトリクス中の核酸を分解することによってバイオフィルムの崩壊が起こることが示唆された。
バイオフィルム阻害剤を探索するため、化合物ライブラリーからスクリーニングを行った。MRSAのバイオフィルム形成を阻害する化合物を21個取得した。バイオフィルム阻害活性の高い化合物についてその作用機序を解析した結果、多糖の形成を阻害することが判明した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成において、Eapと相補的に機能する細胞壁アンカータンパク質を同定できた。②黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの崩壊に寄与するヌクレアーゼを特定できた。③ハイスループットスクリーニングにより、MRSAのバイオフィルム形成阻害活性を示す複数の低分子化合物を取得し、作用機序の一端を解明できた。計画書の作成段階で、予想される問題点を明確にしていたことと、具体的な達成目標を定め多方面からの検討を柔軟に行ったことにより、おおむね計画通りに進んだ。また、研究代表者と分担者が互いの専門領域で柔軟に対処したことも大きな要因と言える。

Strategy for Future Research Activity

黄色ブドウ球菌の細胞外分泌タンパク質Eapは、バイオフィルム形成を促進した。臨床分離株のEap単独欠損株を作製したが、バイオフィルムの形成は低下しなかった。このことよりEapは他のタンパク質との相補的に機能し、バイオフィルム形成に関与していると考え、細胞壁にタンパク質を共有結合させる膜タンパク質であるsortase A(srtA)との二重欠損株としたところ、著しいバイオフィルム形成の低下を認めた。細胞壁タンパク質の欠損株ライブラリーを作製し、EapとSasGの二重欠損株で著しくバイオフィルム形成が低下することを見出した。本年度は、引き続き細胞壁タンパク質の欠損株ライブラリーを作製しつつ、SasGによるコンプリメンテーションとSasGとEapの機能ドメインの詳細な解析を行う。
ヌクレアーゼが核酸の分解を介してバイオフィルムの崩壊を引き起こすことが示唆されたことから、本年度は、黄色ブドウ球菌バイオフィルムにおけるヌクレアーゼの働きを明らかにする。黄色ブドウ球菌のヌクレアーゼ変異株を作成し、バイオフィルム形成・破壊への影響、バイオフィルムマトリクスにおける核酸の量的・質的変化について解析を行う。
ハイスループットスクリーニングシステムを用い、化合物ライブラリーをスクリーニングし、バイオフィルムの形成を阻害あるいは破壊する化合物の取得を目指す。これまでMRSAのバイオフィルム形成を阻害する化合物を21個取得した。さらに、化合物ライブラリーのスクリーニングを継続し、バイオフィルム形成を阻害する化合物の取得を目指す。バイオフィルム阻害活性の高い化合物についてその作用機序を詳細に解析する。
以上より、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成の新規のメカニズムおよびバイオフィルムの阻害物質の作用メカニズム解析を行い、結果を学会発表や論文作成を行う。

Causes of Carryover

予算に計上していた額よりも旅費の支出が少なかったため、平成27年度予算において一部が未使用となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の研究費は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成メカニズムの解明、バイオフィルムの阻害や破壊活性を有する化合物の作用メカニズムを解明するための試薬の購入費および解析費用、国内外における研究成果の発表のための費用として使用する予定である。
また、論文投稿や別刷りのための費用としても使用したいと考えている。

  • Research Products

    (25 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results,  Acknowledgement Compliant: 3 results) Presentation (21 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] A refined technique for extraction of extracellular matrixes from bacterial biofilms and applicability.2015

    • Author(s)
      Chiba A, Sugimoto S, Sato F, Hori S, Mizunoe Y.
    • Journal Title

      Microb Biotechnol

      Volume: 8 Pages: 392-403

    • DOI

      doi: 10.1111/1751-7915.12155

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Antimicrobial and antibiofilm effects of ozonated water for prevention and treatment of bone and joint infections.2015

    • Author(s)
      Koyama R, Okuda K, Matsushita K, Beppu M, Mizunoe Y.
    • Journal Title

      J. St. Marianna Univ

      Volume: 6 Pages: 1-7

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Thioflavin T as a fluorescence probe for monitoring RNA metabolism at molecular and cellular levels.2015

    • Author(s)
      Sugimoto S, Arita-Morioka K, Mizunoe Y, Yamanaka K, Ogura T.
    • Journal Title

      Nucleic Acids Res

      Volume: 43 Pages: e92

    • DOI

      doi: 10.1093/nar/gkv338

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Presentation] 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成を阻害する低分子化合物の作用機序解析.2016

    • Author(s)
      吉井 悠, 奥田 賢一, 山田 聡美, 永倉 茉莉, 杉本 真也, 長野 哲雄, 岡部 隆義, 小島 宏建, 水之江 義充.
    • Organizer
      第89回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      大阪府大阪市
    • Year and Date
      2016-03-23 – 2016-03-25
  • [Presentation] 高分解能液中電顕観察から見えてきたバイオフィルム内部におけるメンブランベシクルの産生と多彩な機能.2016

    • Author(s)
      杉本 真也, 奥田 賢一, 宮川 玲奈, 佐藤 真理, 千葉 明生, 佐藤 主税, 水之江 義充
    • Organizer
      第89回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      大阪府大阪市
    • Year and Date
      2016-03-23 – 2016-03-25
  • [Presentation] ペースメーカーより分離されたPropionibacterium acnes の分子系統解析とバイオフィルム形成.2016

    • Author(s)
      奥田 賢一, 山田 聡美, 杉本 真也, 岩瀬 忠行, 佐藤 真理, 佐藤 主税, 水之江 義充.
    • Organizer
      第89回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      大阪府大阪市
    • Year and Date
      2016-03-23 – 2016-03-25
  • [Presentation] 腸管出血性大腸菌O157 の臨床分離株で見出された一塩基変異によるRpoS の機能不全.2016

    • Author(s)
      岩瀬 忠行, 田嶌 亜紀子, 水之江 義充.
    • Organizer
      第89回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      大阪府大阪市
    • Year and Date
      2016-03-23 – 2016-03-25
  • [Presentation] 大気圧走査電子顕微鏡によるバイオフィルムの液中高分解能観察.2016

    • Author(s)
      杉本 真也, 奥田 賢一, 宮川 玲奈, 佐藤 真理, 千葉 明生, 水之江 義充, 佐藤 主税.
    • Organizer
      第49回日本無菌生物ノートバイオロジー学会総会
    • Place of Presentation
      宮城県仙台市
    • Year and Date
      2016-01-29 – 2016-01-30
    • Invited
  • [Presentation] バイオフィルム感染症制圧の試み.2016

    • Author(s)
      水之江 義充, 奥田 賢一, 岩瀬 忠行, 千葉 明生, 杉本 真也.
    • Organizer
      電子情報通信学会 有機エレクトロニクス研究会
    • Place of Presentation
      熊本県熊本市
    • Year and Date
      2016-01-08 – 2016-01-09
    • Invited
  • [Presentation] バイオフィルム感染症の予防・治療法の開発.2015

    • Author(s)
      水之江 義充.
    • Organizer
      バイオテクノロジー&エレクトロニクス研究討論会
    • Place of Presentation
      東京都墨田区
    • Year and Date
      2015-12-11 – 2015-12-11
  • [Presentation] 細胞外アミロイド産生におけるコシャペロン非依存的な分子シャペロンDnaKの機能.2015

    • Author(s)
      杉本 真也, 有田(森岡) 健一, 山中 邦俊, 小椋 光, 水之江 義充.
    • Organizer
      第38回日本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      兵庫県神戸市
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04
  • [Presentation] Extracellular RNA はバイオフィルムの構造維持に重要である.2015

    • Author(s)
      千葉 明生, 杉本 真也, 水之江 義充.
    • Organizer
      第9回日本細菌学会若手コロッセウム
    • Place of Presentation
      鹿児島県鹿児島市
    • Year and Date
      2015-11-23 – 2015-11-25
  • [Presentation] A refined technique for extraction of extracellular matrices from bacterial biofilms and its applicability.2015

    • Author(s)
      Chiba A, Sugimoto S, Sato F, Hori S, Mizunoe Y.
    • Organizer
      Microbial Stress: From Molecule to Systems
    • Place of Presentation
      Sitges, Spain
    • Year and Date
      2015-11-12 – 2015-11-15
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Inhibition of bacterial biofilms by small compounds targeting molecular chaperone DnaK.2015

    • Author(s)
      Arita-Morioka K, Yamanaka K, Mizunoe Y, Ogura T, Sugimoto S.
    • Organizer
      Microbial Stress: From Molecule to Systems
    • Place of Presentation
      Sitges, Spain
    • Year and Date
      2015-11-12 – 2015-11-15
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 迅速な非侵襲的バイオフィルムECM抽出法の開発.2015

    • Author(s)
      千葉 明生, 杉本 真也, 佐藤 文哉, 堀 誠治, 水之江 義充.
    • Organizer
      第98回日本細菌学会関東支部総会
    • Place of Presentation
      東京都千代田区
    • Year and Date
      2015-10-29 – 2015-10-30
  • [Presentation] 8型分泌装置の発動における細胞質分子シャペロンの機能.2015

    • Author(s)
      杉本 真也.
    • Organizer
      第98回日本細菌学会関東支部総会
    • Place of Presentation
      東京都千代田区
    • Year and Date
      2015-10-29 – 2015-10-30
    • Invited
  • [Presentation] RNAの新機能の発見: Extracellular RNAはバイオフィルムの構造維持に重要である.2015

    • Author(s)
      千葉 明生, 杉本 真也, 水之江 義充.
    • Organizer
      第132回成医会総会
    • Place of Presentation
      東京都港区
    • Year and Date
      2015-10-08 – 2015-10-09
  • [Presentation] 細菌のバイオフィルムマトリクスの解析.2015

    • Author(s)
      水之江 義充, 千葉 明生, 岩瀬 忠行, 杉本 真也.
    • Organizer
      2015年度電子情報通信学会ソサイエティ大会 界面ナノバイオテクノロジーシンポジウム
    • Place of Presentation
      宮城県仙台市
    • Year and Date
      2015-09-08 – 2015-09-11
  • [Presentation] バイオフィルムマトリクスに含まれる細胞外核酸の実態解明.2015

    • Author(s)
      杉本 真也, 千葉 明生, 米本 圭吾, 水之江 義充.
    • Organizer
      新学術領域研究「ゲノム支援」拡大班会議
    • Place of Presentation
      京都府京都市
    • Year and Date
      2015-08-27 – 2015-08-28
  • [Presentation] Extracellular RNAはバイオフィルムの構造維持に重要である.2015

    • Author(s)
      千葉 明生, 杉本 真也, 水之江 義充.
    • Organizer
      第29回日本バイオフィルム学会学術集会
    • Place of Presentation
      愛知県蒲郡市
    • Year and Date
      2015-07-10 – 2015-07-11
  • [Presentation] ペースメーカーより分離されたPropionibacterium acnesによるバイオフィルム形成.2015

    • Author(s)
      奥田 賢一, 杉本 真也, 岩瀬 忠行, 山田 聡美, 水之江 義充.
    • Organizer
      第29回日本バイオフィルム学会学術集会
    • Place of Presentation
      愛知県蒲郡市
    • Year and Date
      2015-07-10 – 2015-07-11
  • [Presentation] 蛍光プローブチオフラビンTによる分子レベル・細胞レベルのRNA代謝の高感度モニター.2015

    • Author(s)
      杉本 真也, 有田(盛岡) 健一, 水之江 義充, 山中 邦俊, 小椋 光.
    • Organizer
      第29回日本バイオフィルム学会学術集会
    • Place of Presentation
      愛知県蒲郡市
    • Year and Date
      2015-07-10 – 2015-07-11
  • [Presentation] DnaK/Hsp70シャペロンシステムはVIII型分泌装置の発現と品質を制御する.2015

    • Author(s)
      杉本 真也, 有田 健一, 山中 邦俊, 小椋 光, 水之江 義充.
    • Organizer
      第12回21世紀大腸菌研究会
    • Place of Presentation
      滋賀県大津市
    • Year and Date
      2015-06-04 – 2015-06-05
  • [Presentation] 分子シャペロンDnaKをターゲットにした小分子化合物を用いた新規バイオフィルム阻害法の開発.2015

    • Author(s)
      有田 健一, 山中 邦俊, 水之江 義充, 小椋 光, 杉本 真也.
    • Organizer
      第12回21世紀大腸菌研究会
    • Place of Presentation
      滋賀県大津市
    • Year and Date
      2015-06-04 – 2015-06-05
  • [Remarks] 東京慈恵会医科大学 医学部医学研究科 細菌学講座 水之江研究室

    • URL

      http://square.umin.ac.jp/saikin/

URL: 

Published: 2017-01-06  

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