2015 Fiscal Year Annual Research Report
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26293100
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
水之江 義充 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (20157514)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉本 真也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60464393)
田嶌 亜紀子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70317973)
奥田 賢一 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70624245)
岩瀬 忠行 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (80385294)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / 黄色ブドウ球菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
黄色ブドウ球菌の細胞外分泌タンパク質Extracellular adherence protein （Eap）は、バイオフィルム形成を促進した。臨床分離株のEap単独欠損株を作製したが、バイオフィルムの形成は低下しなかった。このことよりEapは他のタンパク質との相補的に機能し、バイオフィルム形成に関与していると考え、細胞壁にタンパク質を共有結合させる膜タンパク質であるsortase A（srtA）との二重欠損株としたところ、著しいバイオフィルム形成の低下を認めた。
srtAはグラム陽性菌に存在する20数種の特徴的なmotifをもつタンパク質を細胞壁に局在化できるため、これらのタンパク質のいずれかとEapが相補的に機能することでバイオフィルム形成に関与していると考えられた。そこで、細胞壁タンパク質の欠損株ライブラリーを作製した。その結果、EapとSasGの二重欠損株で著しくバイオフィルム形成が低下することを見いだした。
黄色ブドウ球菌バイオフィルム形成の経時的変化を解析したところ、バイオフィルム形成後に崩壊がみられ、この崩壊メカニズムの解明を試みた。バイオフィルムの細胞外マトリクス解析から、バイオフィルム崩壊に伴いマトリクス中の核酸の分解がみられた。崩壊したバイオフィルム上清中にはヌクレアーゼ活性がみられ、ヌクレアーゼの添加によりバイオフィルムは崩壊した。以上より菌が産生するヌクレアーゼがバイオフィルムマトリクス中の核酸を分解することによってバイオフィルムの崩壊が起こることが示唆された。
バイオフィルム阻害剤を探索するため、化合物ライブラリーからスクリーニングを行った。MRSAのバイオフィルム形成を阻害する化合物を21個取得した。バイオフィルム阻害活性の高い化合物についてその作用機序を解析した結果、多糖の形成を阻害することが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成において、Eapと相補的に機能する細胞壁アンカータンパク質を同定できた。②黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの崩壊に寄与するヌクレアーゼを特定できた。③ハイスループットスクリーニングにより、MRSAのバイオフィルム形成阻害活性を示す複数の低分子化合物を取得し、作用機序の一端を解明できた。計画書の作成段階で、予想される問題点を明確にしていたことと、具体的な達成目標を定め多方面からの検討を柔軟に行ったことにより、おおむね計画通りに進んだ。また、研究代表者と分担者が互いの専門領域で柔軟に対処したことも大きな要因と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
黄色ブドウ球菌の細胞外分泌タンパク質Eapは、バイオフィルム形成を促進した。臨床分離株のEap単独欠損株を作製したが、バイオフィルムの形成は低下しなかった。このことよりEapは他のタンパク質との相補的に機能し、バイオフィルム形成に関与していると考え、細胞壁にタンパク質を共有結合させる膜タンパク質であるsortase A（srtA）との二重欠損株としたところ、著しいバイオフィルム形成の低下を認めた。細胞壁タンパク質の欠損株ライブラリーを作製し、EapとSasGの二重欠損株で著しくバイオフィルム形成が低下することを見出した。本年度は、引き続き細胞壁タンパク質の欠損株ライブラリーを作製しつつ、SasGによるコンプリメンテーションとSasGとEapの機能ドメインの詳細な解析を行う。
ヌクレアーゼが核酸の分解を介してバイオフィルムの崩壊を引き起こすことが示唆されたことから、本年度は、黄色ブドウ球菌バイオフィルムにおけるヌクレアーゼの働きを明らかにする。黄色ブドウ球菌のヌクレアーゼ変異株を作成し、バイオフィルム形成・破壊への影響、バイオフィルムマトリクスにおける核酸の量的・質的変化について解析を行う。
ハイスループットスクリーニングシステムを用い、化合物ライブラリーをスクリーニングし、バイオフィルムの形成を阻害あるいは破壊する化合物の取得を目指す。これまでMRSAのバイオフィルム形成を阻害する化合物を21個取得した。さらに、化合物ライブラリーのスクリーニングを継続し、バイオフィルム形成を阻害する化合物の取得を目指す。バイオフィルム阻害活性の高い化合物についてその作用機序を詳細に解析する。
以上より、黄色ブドウ球菌のバイオフィルム形成の新規のメカニズムおよびバイオフィルムの阻害物質の作用メカニズム解析を行い、結果を学会発表や論文作成を行う。
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| Causes of Carryover |
予算に計上していた額よりも旅費の支出が少なかったため、平成27年度予算において一部が未使用となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の研究費は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの形成メカニズムの解明、バイオフィルムの阻害や破壊活性を有する化合物の作用メカニズムを解明するための試薬の購入費および解析費用、国内外における研究成果の発表のための費用として使用する予定である。
また、論文投稿や別刷りのための費用としても使用したいと考えている。
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[Presentation] バイオフィルム感染症制圧の試み.2016
Author(s)
水之江 義充, 奥田 賢一, 岩瀬 忠行, 千葉 明生, 杉本 真也.
Organizer
電子情報通信学会 有機エレクトロニクス研究会
Place of Presentation
熊本県熊本市
Year and Date
2016-01-08 – 2016-01-09
Invited
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[Presentation] 細菌のバイオフィルムマトリクスの解析.2015
Author(s)
水之江 義充, 千葉 明生, 岩瀬 忠行, 杉本 真也.
Organizer
2015年度電子情報通信学会ソサイエティ大会 界面ナノバイオテクノロジーシンポジウム
Place of Presentation
宮城県仙台市
Year and Date
2015-09-08 – 2015-09-11
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