ATL細胞の表現型の基盤となる量的・質的遺伝子発現異常の包括的解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293226
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 渡邉 俊樹 東京大学, 新領域創成科学研究科, 教授 (30182934)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内丸 薫 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (60251203) ; 中野 和民 東京大学, 新領域創成科学研究科, 助教 (60549591) ; 矢持 忠徳 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特任研究員 (80306844) ; 山岸 誠 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特任研究員 (90625261)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 血液腫瘍学 / ゲノム機能発現

Outline of Annual Research Achievements

ATL細胞におけるNF-kBの恒常的活性化の原因の一つとして、TAK1-p38経路の活性化を明らかにした。TAK1は定型的経路の慢性的な活性化を誘導し、またp38を介して様々な転写因子の制御に関わることがわかった。またATL細胞の網羅的発現解析から、EVC1/2遺伝子座のエピジェネティック異常がHedgehog経路の活性化を引き起こし、ATL細胞の増殖、抗アポトーシスに作用していることがわかった。TAK1、p38、Hedgehog経路に対する特異的阻害剤は、いずれもATL細胞に著しいアポトーシスを誘導することから、新規標的分子として有用であると考えられた。
ATL細胞のエピゲノム異常をChIP-on-chipを用いて明らかにした。ATL細胞はH3K27me3パターンが劇的に変化しており(リプログラミング)、メチル化の異常な蓄積が非常に多くの遺伝子群を負に制御することにより、腫瘍細胞としての特性を維持していることがわかった。制御される遺伝子群には機能未知な転写因子やmicroRNAが多数同定され、さらに複雑な遺伝子制御ネットワークの存在が示唆された。またTaxによって不死化したT細胞はATL細胞に酷似したエピゲノム異常を示したことから、これらが腫瘍化の初期過程であると考えられた。H3K27メチル化酵素EZH2に対する特異的阻害剤はATL細胞及びTax不死化細胞の増殖及び生存能を特異的に抑制することがわかった。
内丸らが開発したHAS (HTLV-1 Analysis System)-Flow法によってATL患者由来腫瘍細胞、感染細胞、非感染細胞におけるスプライシング・バリアントの種類と量がどのように変化するのか検討し、非感染細胞から腫瘍細胞にむけて、個別のmRNA (CASPASE8、HELIOSなど) 異常バリアントの増加を認めた。さらに次世代シーケンス技術を用いて網羅的にスプライシング異常の蓄積を解析する実験条件の検討を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

シグナル伝達系の検討では、初年度に予定していたp38経路活性化の原因とインパクトを明らかにし、さらに次年度以降に計画していたHedgehog経路の活性化メカニズムについても詳細に明らかすることができた(Cancer Sci., 2014)。エピジェネティック制御とHedgehog経路の興味深い関係も明らかになり、大きな成果が得られたと考える。特異的阻害剤の有効性の確認も達成したので、臨床応用に資するさらなる検討を計画している。
ATL細胞のエピゲノム異常については、これまでに我々が行った大規模解析データと本研究の成果を統合することにより、初年度でATL細胞のエピゲノム異常の全体像をつかむことができた。興味深いことに、EZH2遺伝子に既知の活性化変異が認められないにもかかわらず、他の癌におけるエピゲノム異常を凌駕する質と量の異常を検出したことから、ATL細胞はH3K27me3の異常に強く依存した腫瘍であると考えられた。実際に、臨床応用が期待されているEZH2阻害剤がATL細胞に対して有効であり、表現系を規定する詳細な分子機構の解明が必要である。次年度以降に予定していた他のヒストン修飾やHTLV-1感染細胞におけるエピゲノム異常についてもすでに検討を開始しており、順調に進んでいる。
スプライシング異常の検討については、ATL患者の血液サンプルを次世代シーケンサーで解析するための様々な実験条件検討や、サンプル調整側（渡邉・内丸研究室）と解析担当側（菅野・鈴木研究室）との事前打ち合わせを行い、解析ルートのセットアップを完了した。次年度以降の網羅的解析によって全貌を明らかにできると想定している。

Strategy for Future Research Activity

ATL細胞及びTax不死化細胞について、初年度の網羅的解析に加えH3K4me3及びメチル化DNAの網羅的解析を行い、遺伝子発現パターンを規定するエピジェネティック異常の全貌を明らかにする。HTLV-1感染から腫瘍化までの時間的及び空間的なマッピングを行い、表現型及び病気の進展に寄与するエピジェネティクス異常の遺伝子セットと階層性を明らかにする。またこれまでに明らかにしたATL細胞におけるmicroRNAの全体的な発現減少とエピジェネティック異常の関係性を検討する。
またエピジェネティック網羅的解析データを用いて、異常なクロマチン制御と遺伝子発現パターンから発生するシグナル伝達系の恒常的な活性化の詳細な分子メカニズムを明らかにする。とくにH3K4me3によるHedgehog経路の活性化、H3K27me3によるmicroRNAの発現抑制を介したNF-kB経路の活性化に注目し、エピジェネティック異常の原因、細胞表現型への寄与、フィードバック機構などについて詳細に検討を行う。さらに同定した経路に対する各種阻害剤の有効性を検討する。
細胞株由来mRNA (HTLV-1非感染細胞株:Jurkat、HTLV-1感染細胞株: MT-2、ATL患者由来細胞株: TL-Om1)またはprimary cell由来 mRNA (健常人PBMC、HTLV-1キャリアPBMC、ATL患者PBMC)を用いてexon array解析を行い、HTLV-1感染と腫瘍化に伴うスプライシング異常の蓄積の全体像を把握する。また、HAS-Flow法によってATL患者T細胞より分取した非感染、感染、腫瘍細胞からtotal RNAを抽出し、次世代シーケンサーによりmRNAの質と量を網羅的に解析し比較検討を行う。

Research Products

• [Journal Article] Advanced HTLV-1 carriers and early-stage indolent ATLs are indistinguishable based on CADM1 positivity in flow cytometry (2015)
  • Author(s): Kobayashi S, Watanabe E, Ishigaki T, Ohno N, Yuji K, Nakano K, Yamochi T, Watanabe N, Tojo A, Watanabe T, Uchimaru K
  • Journal Title: Cancer Sci Volume: 印刷中 Pages: 未定
  • DOI: doi: 10.1111/cas.12639
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of TL-Om1, an ATL Cell Line, as a Reference Material for Human T-Lymphotropic Virus 1 Quantitative PCR (2015)
  • Author(s): Kuramitsu M, Okuma K, Yamagishi M, Yamochi T, Firouzi S, Momose H, Mizukami T, Takizawa K, Araki K, Sugamura K, Yamaguchi K, Watanabe T, Hamaguchi I
  • Journal Title: J Clin Microbiol Volume: 53(2) Pages: 587-596
  • DOI: doi: 10.1128/JCM.02254-14
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] HTLV-1キャリアが産生するウイルス構造蛋白質に対する抗体と末梢血中のプロウイルス量に関する解析 (2014)
  • Author(s): 井上由紀子，守田麻衣子，後藤信代，相良康子，入田和男，矢持忠徳，渡邉俊樹，岩永正子，浜口功，清川博之
  • Journal Title: 日本輸血細胞治療学会誌 Volume: 60(6) Pages: 592-599
  • DOI: doi: 10.1111/cas.12480
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epigenetic deregulation of Ellis Van Creveld confers robust Hedgehog signaling in adult T-cell leukemia (2014)
  • Author(s): Takahashi R; Yamagishi M, Nakano K, Yamochi T, Yamochi T, Fujikawa D, Nakashima M, Tanaka Y, Uchimaru K, Utsunomiya A, Watanabe T
  • Journal Title: Cancer Sci Volume: 105(9) Pages: 1160-1169
  • DOI: doi: 10.1111/cas.12480
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development and validation of a new high-throughput method to investigate the clonality of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites (2014)
  • Author(s): Firouzi S, López Y, Suzuki Y, Nakai K, Sugano S, Yamochi T, Watanabe T
  • Journal Title: Genome Med Volume: 6(6) Pages: 46
  • DOI: doi:10.1186/gm568
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] CADM1 expression and stepwise downregulation of CD7 are closely associated with clonal expansion of HTLV-1-infected cells in adult T-cell leukemia/lymphoma (2014)
  • Author(s): Kobayashi S, Nakano K, Watanabe E, Ishigaki T, Ohno N, Yuji K, Oyaizu N, Asanuma S, Yamagishi M, Yamochi T, Watanabe N, Tojo A, Watanabe T, Uchimaru K
  • Journal Title: Clin Cancer Res Volume: 20(11) Pages: 2851-2861
  • DOI: DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-13-3169
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Landscape of genetic alterations in adult T-cell leukemia/lymphoma (2014)
  • Author(s): Kataoka K, Nagata Y, Kitanaka A, Sato-Otsubo A, Totoki Y, Yasunaga J, Sanada M, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Suzuki H, Sato Y, Shiozawa Y, Yoshizato T, Kon A, Yoshida K, Munakata W, Nakamura H, Hama N, Shide K, Kubuki Y, Watanabe T（35人中31番目）, Ogawa S
  • Organizer: 56th of ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Moscone Center, San Francisco, U.S.A.
  • Year and Date: 2014-12-07 – 2014-12-07
• [Presentation] Novel Biological Effects and Distinct Patterns of Rhoa Mutations in Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma and Angioimmunoblastic T Cell Lymphoma (2014)
  • Author(s): Nagata Y, Enami T, Kontani K, Kataoka K, Sakata-Yanagimoto M, Kitanaka A, Sato A, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Shiozawa Y, Yoshizato T, Kon A, Yoshida K, Sanada M, Ishiyama K, Miyawaki S, Ishii R, Nureki O, Miyano S, Shimoda K, Watanabe T, Katada T, Chiba S, Ogawa S
  • Organizer: 56th of ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Moscone Center, San Francisco, U.S.A.
  • Year and Date: 2014-12-07 – 2014-12-07
• [Presentation] Monitoring clonal composition of HTLV-1-infected cells based on provirus integration sites (2014)
  • Author(s): Firouzi S, Yamochi T, Lopez O, Suzuki Y, Nakai K, Sugano S, Watanabe T
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜、横浜
  • Year and Date: 2014-11-27 – 2014-11-27
• [Presentation] 成人T細胞白血病におけるEZH2依存的エピジェネティック異常の包括的解析 (2014)
  • Author(s): 堀真琴、藤川大、中川翔太、田中勇悦、中野和民、渡邉俊樹、山岸誠
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜、横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-25
• [Presentation] CD30 expressing cells in HTLV-1 carriers reveal abnormal nuclear morphology resembling flower cells (2014)
  • Author(s): Nakashima M, Yamochi T, Higashihara M, Watanabe T, Horie R
  • Organizer: 第76回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場、大阪
  • Year and Date: 2014-11-01 – 2014-11-01
• [Presentation] Tumor-specific gene expression leads to p38 and Hedgehog signaling activation in adult T cell leukemia (2014)
  • Author(s): Yamagishi M, Takahashi R, Sakai N, Fujikawa D, Nakagawa S, Yamochi T, Yamochi T, Nakano K, Uchimaru K, Utsunomiya A, Watanabe T
  • Organizer: 第76回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場、大阪
  • Year and Date: 2014-11-01 – 2014-11-01
• [Presentation] Distinct patterns of RHOA mutations in Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma and peripheral T-Cell lymphomas (2014)
  • Author(s): Nagata Y, Enami T, Sakata-Yanagimoto M, Kataoka K, Kitanaka A, Sato A, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Shiozawa Y, Yoshizato T, Kon A, Yoshida K, Sanada M, Ishiyama K, Miyawaki S, Ishii R, Nureki O, Miyano S, Shimoda K, Watanabe T, Chiba S, Ogawa S
  • Organizer: 第76回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場、大阪
  • Year and Date: 2014-11-01 – 2014-11-01
• [Presentation] Landscape of genetic alterations in adult T-cell leukemia/lymphoma (2014)
  • Author(s): Kataoka K, Nagata Y, Kitanaka A, Sato-Otsubo A, Totoki Y, Yasunaga J, Sanada M, Shiraishi Y, Chiba K, Tanaka H, Suzuki H, Sato Y, Shiozawa Y, Yoshizato T, Kon A, Yoshida K, Munakata W, Nakamura H, Hama N, Shide K, Kubuki Y, Watanabe T（35人中31番目）, Ogawa S
  • Organizer: 第76回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場、大阪
  • Year and Date: 2014-11-01 – 2014-11-01