革新的細胞チップ技術を用いた感染症に対する個の免疫医療の創成

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293237
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 村口 篤 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (20174287)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岸 裕幸 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (60186210) ; 小澤 龍彦 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (10432105) ; 浜名 洋 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (90551549)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: リンパ球チップ / Tリンパ球 / T細胞受容体 / 免疫治療 / 個の免疫

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度の研究実績の概要は以下のとおりである。
1)細胞チップ上で抗原特異的CD4+ T細胞を検出する方法を確立した。実験には、I-Ab MHC クラス Ⅱ分子に結合した結核菌由来ペプチドを認識するP25 TCR トランスジェニックマウスを用いた。まず、I-Ab分子を発現した細胞から細胞膜ミセルに抗原ペプチドを負荷してＴ細胞を刺激した結果、ペプチド負荷でT細胞のサイトカイン産生が見られた。次に、I-Ab分子組換えタンパクを細胞で発現させ、界面活性剤で抽出後、抗原ペプチドを負荷してＴ細胞を刺激した結果、抗原ペプチド負荷によりT細胞のサイトカイン産生が見られた。
2)単一細胞からのTCR遺伝子の単離は、T細胞の持つTCR-mRNAの量が少ないため、困難を伴う。この困難を克服するために、T細胞をあらかじめanti-CD3,IL-2, IL-4,マイトゲン等でin vitroで活性化して、RT-PCRを行うと増幅率が上がるかどうかを検討した。その結果、活性化によりTCR遺伝子の単離の確率が飛躍的に上昇した。
3)これまで、取得したTCRの機能解析は、発現ベクターに組み込んだTCR遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いてTCR欠損、CD4あるいはCD8遺伝子を導入したT細胞株（TG40）に導入し、TCR/CD3分子を膜に発現させて、ペプチドを発現させた抗原提示細胞で刺激し、活性化マーカーCD69の発現あるいはIL-2産生をFACSで測定してきたが、バックグランドが高いという課題があった。そこで、EG40細胞以外のさまざまな細胞株に外来性TCRを発現させ、機能解析ができるか否かを検証した。その結果、他の細胞株を用いて、より確実に迅速に機能解析が行えることが示された。また、その細胞株で直接、細胞を傷害できる可能性も示された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、我々が独自に開発した「リンパ球チップ」という革新的なリンパ球単離技術を基盤として、抗体およびT細胞受容体（TCR）cDNAを迅速に単離し、「個の免疫医療システム」を確立することを目的としている。
これまでの研究成果として、1)まず、新規マイクロウエルチップの開発を目的として、磁気盤をチップに配置した磁気チップに磁気ビーズをコートした細胞を播種する方法で、細胞導入率を飛躍的に上げることができた。2) 次に、抗原特異的T細胞の単一細胞の検出法（T-ISAAC）の確立を目的として、各ウェルに１個づつＴ細胞を播種し、チップ上で細胞をPMA/ionomycinで刺激し、23万個のT 細胞のサイトカイン産生を単一細胞レベルで検出できる方法を確立した。3) また、抗原特異的CD8+T細胞をT-ISAACで検出するために、CD8+ T 細胞自身のMHC クラスⅠ分子に抗原ペプチドを負荷し、チップ内で刺激し、抗原特異的にサイトカイン産生細胞を検出することができた。
さらに、平成27年度の研究実績として、1)細胞チップ上でCD4+ T 細胞を抗原ペプチド刺激しサイトカインを産生させ、抗原特異的CD4+ T細胞を検出する方法を確立した。2) 次に、T細胞をあらかじめanti-CD3,IL-2, IL-4,マイトゲン等でin vitroで活性化することでTCR遺伝子の単離の確率が飛躍的に上昇させた。3)また、EG40細胞以外のさまざまな細胞株に単離したTCRを発現させ、機能解析が確実で迅速にできるシステムを開発中である。
このように、本研究は目的に沿って、概ね順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

1)取得TCRの新たな機能解析法の開発：これまで、取得したTCRの機能解析は、発現ベクターに組み込んだTCR遺伝子を、レトロウイルスベクターを用いてTCR欠損、CD4あるいはCD8遺伝子を導入したT細胞株（TG40）に導入し、TCR/CD3分子を膜に発現させて、ペプチドを発現させた抗原提示細胞で刺激し、活性化マーカーCD69の発現あるいはIL-2産生をFACSで測定してきたが、バックグランドが高いという課題があった。平成27年度には、EG40細胞以外のさまざまな細胞株に外来性TCRを発現させ、機能解析ができるか否かを検証し、他の細胞株を用いて、より確実に迅速に機能解析が行えることが示された。今後、この細胞株を用いて新たな機能開発法を開発する。
2)可溶化TCR作製法の確立： 2種類、すなわち、sTCR（V領域とC領域を含む2量体）とscFv-TCR（単鎖可変領域からなる1量体）のTCR遺伝子を構築する。この遺伝子を大腸菌あるいはCHO細胞などに発現させ、可溶化TCRを得る。また、TCRの親和性を上げるために、TCRをマルチマー化する。最終年度までに、安定で高機能、高親和性の可溶化TCRの開発を集中的に行う予定である。
3)ウエストナイルウイルスに対するヒトモノクローナル/可溶性TCRの樹立とそれらによる予防・治療効果の検討：ウエストナイルウイルス(WNV)は、高齢者層を中心に致死性の脳炎・髄膜炎を惹き起こす蚊媒介性のヒト感染性ウイルスである。本研究では、日本脳炎ワクチン接種後約１ヶ月後の血液からヒト抗ウエストナイルウイルスモノクローナル抗体を複数個樹立し、ウエストナイルウイルス感染に対する予防・治療効果を、マウスを使った動物実験で確かめる。

Causes of Carryover

平成27年度の研究は計画通り順調に進展したが、チップを使った実験を行う必要が少なかったためチップにかかる費用が減少したことと、平成26年度に繰り越した金額が多かったことで次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度は最終年度のため、これまで以上に研究を進展させるとともに、国外・国内を問わず積極的に学会等に参加して成果の発信に努める予定である。

Research Products

• [Journal Article] Identification of broadly conserved cross-species protective Leishmania antigen and its responding CD4+ T cells. (2015)
  • Author(s): Mou Z, Li J, Boussoffara T, Kishi H, Hamana H, Ezzati P, Hu C, Yi W, Liu D, Khadem F, Okwor I, Jia P, Shitaoka K, Wang S, Ndao M, Petersen C, Chen J, Rafati S, Louzir H, Muraguchi A, Wilkins JA, Uzonna JE.
  • Journal Title: Sci Transl Med. Volume: 7 Pages: 310ra167
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.aac5477.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Immunological features of T cells induced by human telomerase reverse transcriptase-derived peptides in patients with hepatocellular carcinoma. (2015)
  • Author(s): Mizukoshi E, Nakagawa H, Kitahara M, Yamashita T, Arai K, Sunagozaka H, Fushimi K, Kobayashi E, Kishi H, Muraguchi A, Kaneko S.
  • Journal Title: Cancer Lett. Volume: 364 Pages: 98-105
  • DOI: 10.1016/j.canlet.2015.04.031.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. (2015)
  • Author(s): Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 5 Pages: 11333
  • DOI: 10.1038/srep11333.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Human Anti-M2 Antibody Mediates Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) and Cytokine Secretion by Resting and Cytokine-Preactivated Natural Killer (NK) Cells. (2015)
  • Author(s): Simhadri VR, Dimitrova M, Mariano JL, Zenarruzabeitia O, Zhong W, Ozawa T, Muraguchi A, Kishi H, Eichelberger MC, Borrego F.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 10 Pages: e0124677
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0124677.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Monoclonal antibody against citrullinated peptides obtained from rheumatoid arthritis patients reacts with numerous citrullinated microbial and food proteins. (2015)
  • Author(s): Tsuda R, Ozawa T, Kobayashi E, Hamana H, Taki H, Tobe K, Sugiyama E, Iwamoto M, Imura J, Kishi H, Muraguchi A.
  • Journal Title: Arthritis Rheumatol. Volume: 67 Pages: 2020-2031
  • DOI: 10.1002/art.39161.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Comprehensive T-Cell Receptor Repertoire Analysis Using Deep Sequencing and Single Cell Cloning Reveals Extreme Oligoclonality of Ex Vivo Expanded Cytomegalovirus-Reactive Cytotoxic T-Cells. (2015)
  • Author(s): Miyama T, Kawase T, Kitaura K, Chishaki R, Shibata M, Oshima K, Hamana H, Kishi H, Kuzushima K, Saji H, Suzuki R, Ichinohe T.
  • Organizer: The 57th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Orlando（米国）
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ISAAC法を用いた関節リウマチ患者由来自己抗体の単離とその自己抗体が認識する新しい自己抗原の同定． (2015)
  • Author(s): 小澤龍彦，津田玲奈，浜名 洋，多喜博文，戸邉一之，杉山英二，岩本雅弘，井村穣二，岸 裕幸，村口 篤．
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 抗膜タンパク質ウサギ高親和性モノクローナル抗体のエピトープ配列を由来とする新規アフィニティタグの開発． (2015)
  • Author(s): 矢野智也，竹田浩之，小澤龍彦，村口 篤，澤崎達也．
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いた膜タンパク質間トランス相互作用解析技術． (2015)
  • Author(s): 栄谷紘一，竹田浩之，小澤龍彦，村口 篤，澤崎達也．
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ISAAC法による日本脳炎ワクチン被接種者末梢血単核球からのヒト抗ウエストナイルウイルス中和モノクローナル抗体の樹立． (2015)
  • Author(s): 正木秀幸，小澤龍彦，高崎智彦，青山幾子，弓指孝博，小西英二，岸 裕幸，村口 篤．
  • Organizer: 第63回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Assessment of T cell receptor function. (2015)
  • Author(s): Kishi H, Hamana H, Shitaoka K, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Development of an NFAT-luciferase reporter system for screening of antigen-specific TCRs using non-T cells. (2015)
  • Author(s): Hamana H, Kishi H, Shitaoka K, Piao X, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Identification of T-cell receptors of the CD8+ T cells in response to HLA-A24 restricted epitopes from hepatitis B virus. (2015)
  • Author(s): Tamai T, Kishi H, Shitaoka K, Hamana H, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Identification of tumor-specific T cell receptors from primary tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) obtained from B16F10 melanoma-bearing mice. (2015)
  • Author(s): Shitaoka K, Kishi H, Hamana H, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Reactivity of a monoclonal ACPA obtained from RA patient with numerous citrullinated antigens. (2015)
  • Author(s): Ozawa T, Tsuda R, Hamana H, Taki H, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] TRAIL receptor-1 IgM antibodies strongly induced apoptosis in cancer cells. (2015)
  • Author(s): Piao X, Ozawa T, Kishi H, Shitaoka K, Hamana H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Isolation of monoclonal anti-TRIM21/Ro52 autoantibodies from collagen disease-patients with interstitial lung disease and their reactivity to the peptide library. (2015)
  • Author(s): Obi M, Ozawa T, Taki H, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Establishment of West Nile virus-neutralizing human monoclonal antibodies derived from the individuals vaccinated with inactivated Japanese encephalitis virus by ISAAC technology. (2015)
  • Author(s): Masaki H, Ozawa T, Takasaki T, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Single Cell Analysis of Antigen Receptors of Lymphocytes for Tumor Immunology and Immunotherapy. (2015)
  • Author(s): Kishi H.
  • Organizer: The Korean Association of Immunologists 2015 Fall Conference
  • Place of Presentation: Seoul（韓国）
  • Year and Date: 2015-11-12 – 2015-11-13
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Comprehensive analysis of CMV-specific T-cell repertoire by deep sequencing and single cell cloning． (2015)
  • Author(s): 美山貴彦，川瀬孝和，北浦一孝，樗木 錬，柴田真志，大島久美，浜名 洋，岸 裕幸，葛島清隆，佐治博夫，鈴木隆二，一戸辰夫．
  • Organizer: 第77回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-18
• [Presentation] プライマリー腫瘍浸潤リンパ球を用いた腫瘍特異的T細胞受容体同定の試み． (2015)
  • Author(s): 岸 裕幸，村口 篤．
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] 悪性リンパ腫における腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球の解析． (2015)
  • Author(s): 村橋睦了，岸 裕幸，松本太一，原 周司，村口 篤，田村和夫，谷憲三朗．
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] 悪性リンパ腫における腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球の解析． (2015)
  • Author(s): 岸 裕幸，村橋睦了，浜名 洋，松本太一，原 周司，猪狩洋介，石塚賢治，高松 泰，田村和夫，谷憲三朗，村口 篤．
  • Organizer: 第7回血液疾患免疫療法研究会学術集会
  • Place of Presentation: 東京大学伊藤謝恩ホール（東京都文京区）
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Presentation] 悪性リンパ腫における腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球の解析． (2015)
  • Author(s): 村橋睦了，松本太一，浜名 洋，勝屋弘雄，猪狩洋介，石塚賢治，原 周司，岸 裕幸，高松 泰，田村和夫．
  • Organizer: 第13回日本臨床腫瘍学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-07-16 – 2015-07-18
• [Presentation] Distinct pattern of the binding of human monoclonal anti-cyclic citrullinated peptide antibody to joint synovium in between osteoarthritis and rheumatoid arthritis. (2015)
  • Author(s): Iwamoto M, Honne K, Hanai S, Sekiya H, Ozawa T, Kishi H, Muraguchi A, Minota S.
  • Organizer: 2015 Henry Kunkel Meeting
  • Place of Presentation: Annecy（フランス）
  • Year and Date: 2015-04-14 – 2015-04-16
  • Int'l Joint Research