高分化能TET1ヒトiPS細胞を用いた高効率心房筋分別法の確立

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26293313
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 千本松 孝明 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70216563)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 加藤 英政 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50292123) ; 井口 篤志 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (90222851)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヒトiPS細胞 / 心筋細胞 / 間葉系細胞

Outline of Annual Research Achievements

ヒトiPS細胞には分化能の劣る細胞（epiblast stem cell ）が混在することが判明しており、このためヒトiPS細胞を高効率に分化誘導かけることは極めて困難である。しかし、易分解性を解除したTET1を用いて誘導をかけると、現行ヒトiPS細胞に比較して圧倒的に高効率で神経前駆体細胞になることが判明した。そこでTET1 恒常的に発現させてヒトiPS細胞の高効率分化誘導を基盤とした研究を続けている。しかし、ヒトiPS細胞誘導において、患者初代培養間葉系細胞と株化された細胞（市販され、購入可能な細胞）では、その誘導効率において隔世の感があることは禁じ得ない。患者皮膚由来線維芽細胞を用いればヒトiPS細胞誘導は何とか可能であるが、患者左心耳より分別培養された心臓由来線維芽細胞からのヒトiPS細胞誘導は、少なくともエピソーマルベクターの遺伝子導入による山中法を用いた場合、全く誘導することが不可能である。昨年度、培養液の詳細な変更により極めて低い効率であるがヒトiPS細胞の誘導に成功したが、良質なiPS細胞をコンスタントに確保するには、少なくとも数十個のコロニー取得が望ましいが、すべて患者の心臓組織からコンスタントに誘導に成功はしておらず、さらなる改変が必要である。そこで下記の項目が現状の目的となる。1)心臓組織から分別培養した線維芽細胞を用いた高効率ヒトiPS細胞法の確立。2)同一患者の皮膚組織並びに心臓組織から分別された線維芽細胞から誘導されたヒトiPS細胞エピゲノム評価。3)両ヒトiPS細胞からの高効率心臓細胞群分化誘導法の確立4)心房利尿ペプチド分泌能を高めた心房型心筋細胞の作製に焦点をあて研究を行う。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度に、心臓組織（左心耳）より分別培養した線維芽細胞から、培養液の変更で極めて僅かではあるがヒトiPS細胞の誘導に成功し、代表的な未分化遺伝子の発現の確認にてヒトiPS細胞であることは、確認できた。しかし、同様の誘導を何人かの患者組織を用いて行ったが、コンスタントにヒトiPS細胞誘導は起こらず、たとえ出来たとしてもコロニー数は極めて少なく、コウンスタントに分化誘導が掛かる良質ヒトiPS細胞を心臓由来組織から十分に誘導がかけられないでいる。その為、さらなる培養法の変更が必要である。
しかし、山中4因子導入後最初に生じる遺伝子変化として間葉系遺伝子発現の減弱を生じさせることが重要であることは判明しており、Lonza Japan社のNucleofuctor2btmを用いた何種類かの電気穿通法を用いた異なる導入効率と培養液変更のプロトコールの組み合わせにより、およその方向は掴んでおり、まずはベストと言える導入法の確立を目指す。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度は本プロジェクト最終年度であり、幾つかのプロジェクトを並行して施行予定である。患者心臓組織由来線維芽細胞からの高効率ヒトiPS細胞誘導法の確立
その方法を用いて約１０名の心臓組織由来線維芽細胞並びに皮膚由来線維芽細胞よりヒトiPS細胞誘導を行い、同一患者より異なる組織由来ヒトiPS細胞のエピゲノム評価を行う。
また、同一患者でほぼ同一な遺伝子導入効率を示す皮膚由来線維芽細胞と心臓由来線維芽細胞に於いてどのような差異が、ヒトiPS細胞誘導の大きな差異に連関していくるのかを、線維芽細胞レベルでの遺伝子、エピゲノムレベルでの評価を行い、より効率の高いヒトiPS細胞誘導の確立のサポートエビデンスを獲得し、次なるプロジェクトを組み立てる。
更にそのヒトiPS細胞を用いて中胚葉誘導を行い、まずは、心筋細胞群誘導効率を確認する。
しかし現在のところ、心房筋ならびに心室筋を高効率に分別する方法は存在しない。最近心筋細胞表面抗原 signal-regulatory protein alpha (SIRPA) (Nat Biotechnol. 2011 Oct 23;29(11):1011-8. )を用いたフローサイトメトリーにより心筋を分別する論文が発表されたが、心房筋心室筋共にこの表面抗原を有しており、分別には有効ではない。加えてフローサイトメトリーでは、全細胞数の10％程度しか分別出来ないのが現実であり、臨床応用を前提した場合、極めて効率は悪い。そこで心室筋、心房筋分別法としてRNAアプタマーを開発する。

Causes of Carryover

前年度に、心臓組織（左心耳）より分別培養した線維芽細胞から、培養液をよりiPS細胞誘導に最適な変更で、極めてわずかであるがヒトiPS細胞誘導に成功し、代表的な未分化遺伝子群の発現の確認にてヒトiPS細胞に近い状態の細胞であることは確認できた。しかし、同様の誘導を6人の患者組織を用いて施行したがコンスタントにヒトiPS細胞には誘導されず、たとえ出来たとしてもコロニー数は極めて少なく、心臓組織からのコンスタントな良質ヒトiPS細胞誘導法が確立されたとは言い難い状態である。このため、実験がstackした状態となり、研究用資金の使用が滞った時期が生じた。現在最適なプロトコールの確認作業中である。具体的には患者ごとに数種類のプロトコールを用意し実行し、患者特性に合った誘導条件からより多くのコロニー形成が得られるか検討中である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

4種類のヒトiPS細胞誘導用培養液を準備し、上述した実験を実行予定である。special madeのヒトiPS細胞誘導用培養液は極めて高価（3-5万円/500ml）であり、次年度持ち越しさせて頂き、ヒトiPS細胞誘導iPS細胞誘導法をしっかり確立させていきたい。同時に最終年度であり、心筋細胞誘導実験量も増加予定であるため、この点に関しても次年度持ち越しさせて頂き、有効に使用させていただく予定である。