2014 Fiscal Year Annual Research Report
ケロイドの免疫細胞治療を目指して！～制御性T細胞は炎症＆線維化を抑制する～
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26293379
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
村尾 尚規 北海道大学, 大学病院, 助教 (90706558)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古川 洋志 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00399924)
林 利彦 北海道大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (00432146)
舟山 恵美 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (10533630)
山本 有平 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70271674)
小山 明彦 北海道大学, 大学病院, 講師 (70374486)
齋藤 典子 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (80374487)
七戸 龍司 北海道大学, 大学病院, 医員 (30640346)
関堂 充 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40372255)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ケロイド / 免疫 / 制御性T細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度の計画に従い、informed consentの得られたケロイド患者および非ケロイド患者から採取したケロイド組織または非ケロイド正常皮膚組織から線維芽細胞を培養し一部を凍結保存した。また、informed consentの得られたケロイド患者および非ケロイド患者から末梢血を採取し、濃度勾配を用いて単核球を分離し、凍結保存を行った。
正常皮膚組織、ケロイド組織、ケロイド病変と同程度の炎症性病変からの皮膚組織に対して過去に行った病理学的検討にて、ケロイド組織内ではCD4陽性T細胞に占める制御性T細胞（Treg）の比率が他の同程度の炎症性病変と比較して低下しており、TregとエフェクターT細胞（Teff）とのバランスが破綻している可能性を示している。得られたサンプルに対しHE染色、免疫組織学的染色（CD4、CD25、FOXP3染色）を行い、真皮内のCD4陽性T細胞、Treg（CD4陽性、FOXP3陽性細胞）の細胞数や比率を測定した結果、ケロイド組織内のCD4陽性T細胞に占めるTregの比率は過去の報告と同様10％程度であった。
また、Treg/Teffの破綻の有無を証明するため、CD4陽性T細胞におけるTregとTeffの比率を比較していくこととした。まず、非ケロイド患者から分離したCD4陽性T細胞に対して各種の刺激を行った後、抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗FOXP3抗体、抗IL-17抗体、抗IL-10抗体で染色し、フローサイトメーターで解析した。現時点で解析数は少ないため、今後、解析数を重ねてTreg/Teffバランスの破綻の有無や原因の解析を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の目標としてケロイド患者／非ケロイド患者からサンプルを収集する必要があった。ケロイド組織または正常皮膚組織の採取、線維芽細胞の培養、凍結保存を行った。さらに、採取した末梢血から、単核球を分離し、CD4陽性T細胞の分離、培養や凍結保存を行った。
病理組織学的検討においては、ケロイド組織ではCD4陽性T細胞に占めるTregの比率が10％程度であり、他の同程度の炎症性病変と比較して低下していることを確認し、Treg/Teffバランスの破綻が起こっている可能性について示すことができた。
以上のことから、初年度の達成度としてはおおむね順調に進展していると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ケロイド組織におけるTreg/Teffバランスの破綻の原因を証明する。
凍結保存した単核球からCD4陽性T細胞を分離し、通常の方法にて活性化する、またはTGF-βや免疫抑制剤を用いてTregを誘導する。CD4陽性T細胞を抗CD4抗体、抗CD25抗体、抗FOXP3抗体、抗IL-17抗体、抗IL-10抗体で染色し、フローサイトメーターでTreg、Teffの比率を解析する。ケロイド患者ー非ケロイド患者間や刺激方法によるTreg、Teffの比率を比較し、ケロイド患者におけるTreg誘導効率の低下の有無を検証しTreg/Teffバランスの破綻の原因を探る。
さらに、線維芽細胞ーT細胞共培養モデルを用いてケロイド線維芽細胞ーケロイド患者CD4陽性T細胞、正常線維芽細胞ー非ケロイド患者CD4陽性T細胞などの組み合わせで共培養を行い、共培養後のCD4陽性T細胞を解析し、ケロイド局所におけるケロイド線維芽細胞の作用によるTreg誘導抑制の有無を証明する。同時に、共培養後の線維芽細胞を回収し、real time PCRにてⅠ型コラーゲン、TGF-β、α-SMA、IL-6の産生、発現量の解析を進める。
また、初年度に引き続きサンプルの収集や免疫組織学的染色、末梢血CD4リンパ球の解析なども継続し、解析数を増やす方針である。得られた結果については統計学的解析を行った後、関連学会にて発表し、論文の作成、投稿などを行う予定である。
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| Causes of Carryover |
研究はおおむね順調に進展し、予算と支出にほぼ差は生じなかったが、60,563円の次年度使用額が発生した。抗体、試薬などの購入を予定していたが、いずれも50000円程度であったため、次年度使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養のための培地、生化学試薬、Real time PCRの試薬、各種抗体、その他のシャーレ、ピペットなどの実験機材の各種物品などの購入に充てる予定である。
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Research Products
(3 results)
