2014 Fiscal Year Research-status Report
精子幹細胞の放射線による細胞死誘導の分子メカニズムの解明
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26340021
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森本 裕子 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (90540097)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 放射線 / 細胞死 / p53 / 精子幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1)p53ノックアウト(KO)マウス由来精子幹細胞の細胞死誘導の確認：精子幹細胞(SSCs)及び生殖幹細胞(GSCs)においてp53遺伝子KO又はノックダウン(KD)すると放射線照射による細胞死が減少した。
(2)pumaKO由来精子幹細胞の細胞死誘導の解析：GSCs,多能性生殖幹細胞(mGSCs)およびマウス胚性繊維芽細胞(MEF)においてpuma遺伝子をKDすると放射線照射による細胞死が減少し、puma遺伝子を導入すると細胞死を誘導した。
(3)GSCsにおけるTnfsf10-Tnfrsf10b経路の細胞死誘導の解析：放射線照射後のGSCs培養液の上澄みにはTNFRSF10BのリガンドであるTNFSF10が大量に含まれていた。この上澄みを照射していないGSCsに加えると細胞死を誘導した。放射線照射後のGSCsではTnfrsf10b遺伝子の発現が増加し、Tnfrsf10b遺伝子をKDすると放射線照射による細胞死が減少した。しかし、GSCsにTnfrsf10b遺伝子を導入しても細胞死を誘導しなかった。
(4)Trp53inp1によるTnfrsf10b誘導の解析：GSCsにおいてTrp53inp1遺伝子をKDすると放射線照射による細胞死が減少した。GSCsにTrp53inp1遺伝子を導入するとTnfrsf10bの発現が増加し、KDすると放射線照射後のTnfrsf10bの発現が低下した。しかし、GSCsにTrp53inp1遺伝子を導入しても細胞死を誘導しなかった。
(5)Trp53inp1及びTnfrsf10b KOマウス由来精子幹細胞の細胞死誘導の解析：SSCs及びGSCsにおいてTrp53inp1又はTnfrsf10b遺伝子をKO又はKDすると放射線照射による細胞死が減少した。GSCsにおいてTrp53inp1又はTnfrsf10b遺伝子をKDすると化学物質が原因で生じる細胞死も減少した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究計画で予定していた以下の２項目についてはそれぞれ確認及び解析作業が完了した。(1)p53ノックアウト(KO)マウス由来精子幹細胞の細胞死誘導の確認、及び(2)pumaKO由来精子幹細胞の細胞死誘導の解析
本年度はこれらに加えて以下の項目を実施した。(3)生殖幹細胞(GSCs)を用いた放射線に対する細胞応答の解析
また、放射線照射による細胞死誘導に関与する遺伝子(Trp53inp1, Tnfrsf10b)を見出した。
更にTrp53-Trp53inp1-Tnfrsf10b 経路が細胞死誘導に重要である事を見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度以降の研究計画において以下の２項目を予定していた。(1)生殖幹細胞(GSCs)を用いた放射線に対する細胞応答の解析、及び(2)精子幹細胞の放射線耐性に関わる新規ターゲット分子の同定。(1)については既に解析が完了している為、(2)を実施する。
先ず、野生型とp53ノックアウト(KO)マウス由来のGSCsに放射線照射を行い、mRNAを回収してマイクロアレイを実施する。マイクロアレイの結果から野生型GSCsで誘導され、p53KOマウス由来のGSCsでは誘導されないmRNAに着目し新規ターゲットの候補分子とする。
新規ターゲット分子の同定には、第一段階としてshRNAを発現するレンチウィルスを用いてGSCsに遺伝子を導入する事でスクリーニングを行う。第二段階としてレンチウィルスによる遺伝子導入で候補遺伝子の発現を抑制したGSCsに放射線を照射し、その後不妊マウスの精巣内に移植する。これにより放射線を照射後に生存している細胞が幹細胞である事を確認する。更に必要であればKOマウスも利用する事で標的遺伝子を確定する。
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| Causes of Carryover |
海外に発注した試薬の到着が遅れた為。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
海外に発注した試薬が到着次第支払いを行う。
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