2014 Fiscal Year Research-status Report
PCBの血中甲状腺ホルモン濃度低下作用発現に関する新規メカニズムの実体解明
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26340043
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
加藤 善久 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (90161132)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 甲状腺ホルモン撹乱 / サイロキシン / PCB / 肝臓 / トランスポーター / ラット / Kanechlor-500 / 肝実質細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
すでに、polychlorinated biphenyl (PCB)による血中サイロキシン(T4)濃度の低下は、肝臓へのT4の蓄積量の増加に起因していることを明らかにし、このT4濃度の低下作用メカニズムを新規セオリーとして提唱した。本研究では、新たに提唱した血中T4濃度低下作用メカニズムの本質となるT4の肝臓への蓄積メカニズムの実体を解析するために、T4の肝臓への取り込み、排出に関わるトランスポート機構を明らかにするために、以下の検討を行った。
まず、[125I]T4のラット肝実質細胞への取り込みについて検討した。Wistar系ラットにおいて、[125I]T4の肝実質細胞への取り込み量は、T4濃度の増加に伴って増加し、5.0 μM T4で[125I]T4の取り込みは飽和に達した。Wistar系ラットにKanechlor-500（KC500）を処置することにより、その取り込み量は有意に増加し、[125I]T4の取り込みのVmax値は2.4倍、Km値は1.8倍に増加した。
さらに、肝臓における甲状腺ホルモン輸送に関連するトランスポーターのmRNAの発現量について検討を加えた。KC500を投与したWistar系ラットの肝臓において、甲状腺ホルモンを基質とするトランスポーターのうち有機アニオン輸送ポリペプチド、Oatp1、Oatp3、Oatp4、タウロコール酸共輸送ペプチド、Ntcp、L型アミノ酸トランスポーター、LAT2のｍRNAの発現量は変化しなかったが、LAT1、Oatp2のmRNAの発現量はそれぞれ5.0倍、1.4倍に有意に増加した。
以上の結果から、KC500投与後のラットにおける肝実質細胞へのT4の取り込み量の増加には、肝臓のLAT1およびOatp2 mRNAの発現量が増加が関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
すでにPCBの血中T4濃度の低下は、主に肝臓へのT4の蓄積量（移行量）の増加に起因していることを明らかにし、丹念に実験データを積み上げることにより、このT4濃度の低下作用メカニズムを新規セオリーとして提唱した。さらに、肝臓へのT4の蓄積量（移行量）の増加に何らかの甲状腺ホルモントランスポーターが関与していること、またPCBによる血中T4濃度の低下において、この増加の寄与率は、核内レセプターに結合するPCBのタイプによって異なることを示した。
そこで、甲状腺ホルモンの血管側細胞膜から肝実質細胞への取り込みにおいて、トランスポーターの関与の検討に着手した。KC500、CB126、CB118及びCB153をラット、TCDDに高感受性マウス、TCDDに低感受性マウス、モルモット、ハムスター及び遺伝子組み換え動物(甲状腺ホルモン濃度の低下のカギになる酵素やタンパク質、甲状腺ホルモントランスポーターを欠損させた動物)に低用量連続投与を行い、①、②を測定し、それらの関係の検討を進めている。
①血清中甲状腺ホルモン(総T4、遊離T4、総T3、遊離T3、TSH)濃度
②各動物の肝切片を用いて、甲状腺ホルモンやそのグルクロン酸抱合体の輸送に関わるトランスポーターとして、有機アニオン輸送ポリペプチド(OATP1A2､OATP1B1､OATP1B3、OATP1C1､OATP4A1)、タウロコール酸共輸送ペプチド(NTCP)、L型アミノ酸トランスポーター(LAT1、LAT2)、モノカルボン酸トランスポーター(MCT8)及びATP結合カセットトランスポーター(MRP1､MPR2､MRP3、MRP4)の遺伝子及びタンパクレベルでの発現変動への影響を、RT-PCR法及びウエスタンブロット法を用いて測定を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
異なる核内レセプター(AhR、constitutive androstane receptor(CAR)など)に結合するPCB、それらを成分として含み「油症」の原因となったPCB混合物およびヒト血中の残留量が高い水酸化PCBを投与した動物（PCBに対する耐性の異なる動物、遺伝子組み換え動物）を用いて、血中甲状腺ホルモン濃度とともに、甲状腺ホルモンの血管側細胞膜から肝実質細胞への取り込み、肝臓実質細胞からの胆管への排泄及び甲状腺ホルモンの肝臓の蓄積部位の局在性を解析する。
次に、ダブル発現細胞、ヒトトランスポーターを導入した発現細胞及びヒト凍結肝細胞を用いて、PCBによるT4の肝臓への蓄積メカニズムの実体解明を進める。異なるタイプのPCBの血中T4濃度の低下に関わる甲状腺ホルモントランスポーターの寄与率を明らかにし、PCBによるT4濃度低下作用発現メカニズムの動物種差を解明し、ヒトのT4濃度低下作用発現メカニズムに発展させる。また、甲状腺ホルモンの分泌、分解、結合、体内動態などの変動を薬物動態学的及び分子生物学的にin vivoとin vitroで多角的に解析し、相互に関連付けて追求することにより、ヒトでのPCBの血中甲状腺ホルモン濃度低下作用発現メカニズムを解明する。
PCBによる血中T4濃度の低下において提唱した新規メカニズムである肝臓へのT4の蓄積量の増加の要因を、肝臓の甲状腺ホルモンのトランスポーターに焦点を当て、血中甲状腺ホルモン濃度の低下に関わる様々な作用を考え合わせ、遺伝子組み換え動物を巧みに利用した各種実験動物の結果を融合させて統合的に解析する。
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| Causes of Carryover |
すでに、前年度末に、一部の実験は、投与を始め、各種動物の肝切片を凍結保存した。それらの各動物の肝切片を用いて、甲状腺ホルモンやそのグルクロン酸抱合体の輸送に関わるトランスポーターとして、L型アミノ酸トランスポーター、有機アニオン輸送ポリペプチド、ATP結合カセットトランスポーター、タウロコール酸共輸送ペプチドの遺伝子及びタンパクレベルでの発現変動への影響を、RT-PCR法及びウエスタンブロット法を用いて測定したため、動物及び試薬の購入に充てる申請額に未使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験動物にPCB類を投与した時の血中甲状腺ホルモン濃度、甲状腺ホルモンやそのグルクロン酸抱合体の輸送に関わるトランスポーターの遺伝子及びタンパクレベルでの発現変動、甲状腺ホルモンの各種組織への移行量及び肝臓の部位特異的蓄積性の測定などのin vivo実験、ならびにPCB類を投与した動物に、さらに[125I]T4を静脈内投与し、血中[125I]T4の代謝回転、[125I]T4の組織分布量、[125I]T4の肝臓の部位特異的蓄積性、血中[125I]T4と甲状腺ホルモン輸送タンパクとの結合割合、胆汁中T4のグルクロン酸抱合体の排泄量の測定をするex vivo実験において、研究費は、投与用試薬、実験動物、RI実験用試薬、PT-PCR測定用試薬、ウエスタンブロット用試薬、組織免疫学的検査用試薬、HPLC用カラム、ディスポーザブル器具に充てる。未使用額もそれらの経費に充てて研究を推し進める。
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[Journal Article] Distribution and excretion of 2,2',3,4',5,5',6-heptachlorobiphenyl (CB187) and its metabolites in rats and guinea pigs.2015
Author(s)
Chiho Ohta, Koichi Haraguchi, Yoshihisa Kato, Tetsuya Endo, Osamu Kimura, Nobuyuki Koga
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Journal Title
Chemosphere
Volume: 118
Pages: 5-11
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] 3,3',4,4'-Tetrachlorobiphenyl-mediated decrease of serum thyroxine level in C57BL/6 and DBA/2 mice occurs mainly through enhanced accumulation of thyroxine in the liver2014
Author(s)
Yoshihisa Kato, Koichi Haraguchi, Mao Onishi, Shinichi Ikushiro, Tetsuya Endo, Chiho Ohta, Nobuyuki Koga, Shizuo Yamada, and Masakuni Degawa
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Journal Title
Biol. Pharm. Bull.
Volume: 37
Pages: 504-509
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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