飯の糖量に関わるアミラーゼインヒビターの炊飯動態とその作用解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26350115
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 大倉 哲也 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品総合研究所食品機能研究領域, 上席研究員 (70353935)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 米飯 / アミラーゼインヒビター / αグルコシダーゼ / グルコシダーゼインヒビター / 炊飯 / 免疫染色 / イムノブロット / 品種間差

Outline of Annual Research Achievements

米飯の食味に胚乳内デンプンがデンプン分解酵素で分解されて生じる還元糖が寄与することは知られている。が、デンプン分解酵素と相互作用するタンパク質の挙動や食味への寄与については明らかにされていない。本研究では，デンプンを分解するαグルコシダーゼと相互作用するαアミラーゼ/トリプシンインヒビター（以下、アミラーゼインヒビター）に注目し，米の炊飯過程における溶出挙動や米粒一粒レベルからデンプン粒レベルまでの局在の変化等について免疫染色法を主とする解析方法を用いて明らかにすることを目的としている。
平成26年度はαグルコシダーゼ精製画分を抗原としてマウスに免疫し、末梢リンパ球及び脾臓からモノクローナル抗体を調製し、免疫沈降で14kDaのアミラーゼインヒビターを主として認識する抗体を選抜した。この選抜されたモノクローナル抗体を用いて、コシヒカリ玄米の凍結切片（5 m）で免疫染色を行った結果、明確ではないがデンプン粒周囲が検出される結果を得た。同様の結果は、平成27年度に行う予定の他の品種(ミルキークイーンや酒米)においても得られた。αグルコシダーゼのペプチド配列に対するポリクローナル抗体を用いた免疫染色でもデンプン粒の周囲が検出されたことから、アミラーゼインヒビターとαグルコシダーゼとが、玄米において共局在する可能性が示された。今後ブロッキング剤や切片作製条件を至適化することにより、明確な二重染色画像を取得するための検討を来年度も継続して行う。なお、本年度行う予定であった溶出挙動解析については、モノクローナル抗体がイムノブロットには適さなかったことから、14kDaのアミラーゼインヒビターのなかでαグルコシダーゼ阻害活性を持つタンパク質をTOF-MS/MS解析で同定後に、ポリクローナル抗体を作製して次年度以降解析することとした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

イムノブロットについては次年度以降に対応するが、それ以外は順調に進んでおり一部平成27年度に予定されていたことについても研究が進んだため。

Strategy for Future Research Activity

インヒビターの内αグルコシダーゼ活性を阻害する画分にあるタンパク質の同定を早急に進めてこれらの精製とポリクローナル抗体を作製してイムノブロットによる動態解析を進める。