血中循環腫瘍細胞によるがん個別化治療のためのバイオマーカー解析に関する研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26350557
• Research Institution: Toyama Industrial Technology Center,
• Principal Investigator: 高田 耕児 富山県工業技術センター, 機械電子研究所, 主任研究員 (40530621)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 塚田 一博 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (90171967) ; 嶋田 裕 京都大学, 大学院薬学研究科, 准教授 (30216072)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 循環腫瘍細胞 / 癌 / マイクロ流体チップ

Outline of Annual Research Achievements

循環腫瘍細胞（CTC）は血液中を流れる癌細胞であり、癌の転移の原因とも考えられている。このCTCを回収・解析することができれば、癌の検査・診断や患者さん一人ひとりに適した個別化治療などに応用することができる。しかしCTCは数が極めて少ないため（血液1mL中に数個～数十個）、これを回収することは困難であった。これまでの研究において、抗体を固定化したマイクロチップにより、癌細胞を捕捉・固定化する検討を行っており、一定の成果が得られている。しかしながら、このように癌細胞を捕捉した場合、捕捉した癌細胞を回収することが困難となり、癌細胞の解析や培養をする際に制限や問題が生じる。そのため、癌細胞を捕捉するのではなく、解析しやすいように細胞懸濁液の形で回収することが可能な技術が重要となる。
平成26年度は、血液中の癌細胞と他の細胞（赤血球等）をサイズで分離し、癌細胞のみを回収するための樹脂製マイクロチップおよびマイクロチップに試料を流すためのシステムを開発した。開発したマイクロチップに試料（血液と癌細胞を混ぜたもの）を流して分離回収する実験を行ったところ、癌細胞と血液とを従来法より高速に分離できること、癌細胞を細胞懸濁液の形で回収（99％以上を回収）できることを確認した。これにより、今後回収した癌細胞の解析（免疫蛍光法、RT-PCR法等を用いたバイオマーカーの解析等）や培養、臨床サンプルを用いた実験を進めることが可能となった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初は従来の方法で捕捉した細胞の解析をしながら、細胞の回収方法についても検討を行う予定であった。しかしながら、分離した癌細胞について多様な解析をするためには、細胞懸濁液の形での回収が可能な技術がより重要と判断し、マイクロチップの改良を優先して行った。そして癌細胞を分離・回収するための樹脂製マイクロチップおよびマイクロチップに試料を流すためのシステムを開発した。これにより、今後回収した細胞の解析、臨床サンプルを用いた実験をスムーズに進めることが可能となった。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度に開発したマイクロチップを用いて分離・回収した癌細胞の解析法について検討を行う。癌の浸潤、転移と関係するバイオマーカーであるN-cadherin、Cadherin-11、EGFR等を対象として解析を行う。
解析法は免疫蛍光法とRT-PCR法を検討する。免疫蛍光法による解析では、血液に癌細胞を混ぜたサンプルからマイクロチップを用いて分離・回収した癌細胞を上記のバイオマーカー等に対する蛍光標識抗体と反応させ、蛍光顕微鏡によって観察する方法を検討する。複数種の蛍光標識を用いることで、複数のバイオマーカーを同時に観察する。RT-PCR法による解析では、分離・回収した癌細胞のRNAを回収し、そこからRT-PCRまたは定量RT-PCRを行う。
回収した細胞には白血球等が混入することが考えられるため、癌細胞と結合する抗体を固定化した磁気ビーズを用いたポジティブセレクション、あるいは白血球と結合する抗体を固定化した磁気ビーズを用いたネガティブセレクションによって、白血球をさらに取り除く方法についても検討する。この際、磁気ビーズと結合させてからマイクロチップで分離することによって、血液細胞のみならず、フリーの磁気ビーズも取り除いて癌細胞を回収することができるので、従来の磁気ビーズを用いた方法と比べて大きな利点がある。
また、これらの方法を臨床テストで用いるための準備を行い、準備が整い次第、臨床サンプルを用いた実験を行う。

Causes of Carryover

当初は従来の方法で捕捉した細胞の解析をしながら、細胞の回収方法についても検討を行う予定であった。しかしながら、分離した癌細胞について多様な解析をするためには、細胞懸濁液の形での回収が可能な技術がより重要と判断し、平成26年度はマイクロチップの改良を優先して行い、細胞の解析法の検討については本格的に行っていない。そして平成27年度に細胞の解析を本格的に行う。細胞の解析のためには、様々な試薬や抗体などを用いるため、多くの費用が必要となる。その費用が平成26年度は少なく、平成27年度に多く必要となるため、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

細胞の解析のために必要な試薬や抗体などを購入する。また、マイクロチップの製造、細胞培養、細胞分離実験に必要な消耗品、試薬等を購入する。