2015 Fiscal Year Research-status Report
RNA-Seq解析を用いた植物物質生産制御因子の単離及び最低解析数の統計学的検証
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26350967
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| Research Institution | Kazusa DNA Research Institute |
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Principal Investigator |
鈴木 秀幸 公益財団法人かずさDNA研究所, バイオ研究開発部, グループ長 (80276162)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 一彦 近畿大学, 農学部, 教授 (00199796)
尾形 善之 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 准教授 (90446542)
水谷 正治 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (60303898)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | RNA-Seq解析 / 相関ネットワーク解析 / 生合成関連酵素 / 転写因子 / 除虫菊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、植物の物質生産制御因子の単離及び最低解析数の統計学的検証を行うために、相関ネットワーク解析ソフト（金平糖Java-GUI）の改良及びRNA-Seq解析での物質生産に関与する転写因子の単離を行うための効率的な実験計画を提唱することを目的としている。
本研究課題の中核を担う相関ネットワーク解析ソフト（金平糖Java-GUI）の改良に関して、今年度更なる遺伝子共発現ネットワークの描画機能の強化を行った。質量分析機器で得られるメタボローム解析データにも適用例を拡大して、金平糖Java-GUIのプログラム原理と解析適用例を合わせて論文投稿まで準備を行った。本金平糖プログラム原理に関しては、アルゴリズムの特許申請を行った。
次に、殺虫活性を示すエステル化合物ピレスリンを蓄積するキク科植物の除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)を用いて、昨年度取得したHiseq1500 Rapid分析での更なるRNA-Seq解析を実行した。今年度は、ピレスリン生合成経路の全容を明らかにする目的で、遺伝子共発現解析によって未知の生合成関連遺伝子を同定しようと試みた。まず、遺伝子配列をde novo assembleソフトTrinityによりおよそ42万個のcontigを得た。これらのcontigをアノーテーションし、各組織サンプルのリードをマッピングすることによって発現頻度情報を求めた。さらに代謝経路の共発現情報をもとに、この代謝経路上で香気成分によって誘導される遺伝子を探索した。その結果、酸化酵素を中心とするピレスリン生合成遺伝子の候補を効率良く絞り込むことができた。更に、除虫菊幼苗に機械傷を与えると (E)-2-hexenal等を主成分とする揮発性有機化合物(VOC)が放出される現象を基に、RNA-Seq解析から得られた遺伝子発現に対する傷害誘導的に生じるVOCのブレンド作用を調査したところ、本ブレンドは時間依存的に数種の遺伝子の発現を選択的に促進することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度、金平糖アルゴリズムを搭載した金平糖ネットワーク解析（Java-GUI）ソフトの改良が終了し、論文投稿可能な状況に進んだ。ピレスリンを蓄積するキク科植物の除虫菊のRNA-Seq解析のデータ取得も終了し、その遺伝子配列データを基に、除虫菊幼苗の傷害誘導的に生じる揮発性有機化合物(VOC)のブレンド作用の調査を行い、時間依存的に数種の遺伝子の発現を選択的に促進することを見出し、論文投稿・受理も得ている。植物の物質生産制御因子の単離及び最低解析数の統計学的検証を行うことに対して、現在、シロイヌナズナ及びトマトの公開DNAマイクロアレイデータを用いており、結果は得られていないが、老分投稿、論文受理も進んでおり、本研究課題は順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
金平糖アルゴリズムを搭載した金平糖ネットワーク解析（Java-GUI）ソフトに関して、プログラム原理と解析適用例を合わせて論文投稿・受理まで目指す。
除虫菊由来のRNA-Seq解析に関しては、遺伝子機能解析でもう１報論文投稿段階に進んでいるので、これを受理される段階に進展させる。また、除虫菊由来のRNA-Seq解析に
上記の改良型解析ソフト（金平糖Java-GUI）を適用させ、遺伝子共発現相関ネットワーク解析を行う。具体的には、ピレスリン生合成経路に関与する非メバロン酸経路の関連酵素、オキシリピン経路の関連酵素及び鍵酵素であるピレスリン合成酵素（GDSL lipase like acyltransferase）に注目して、遺伝子共発現ネットワークモジュールの抽出を行う。また、抽出されたピレスリン生合成遺伝子群のモジュールメンバーから、未だ遺伝子単離がされていないピレスロロン合成酵素（4'位の水酸基を導入する酵素：P450）及び転写因子の候補遺伝子の選抜及びクローニングを行う。
研究計画が滞る要因として、相関ネットワーク解析で転写因子の候補が複数選ばれることが想定される。その場合には、ピレスリン合成酵素と最も高い相関係数の転写因子に絞る方針である。一方、転写因子の候補が選ばれない場合には、Myb様転写因子のみを選択して、再度相関ネットワーク解析を行い、転写因子を選抜するといった対策を講じ、円滑に研究課題を遂行する。
最後に、モデル植物であるシロイヌナズナ及びトマトの公開DNAマイクロアレイデータの大量データを用いて、既知の二次代謝産物（例えば、アントシアニンやグリコシノレートなど）に関与している転写因子に注目して、必要な最低解析数を考察する方針である。
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| Causes of Carryover |
研究進捗上、近畿大との除虫菊のRNA-Seq解析に集中した。この解析結果より、予定していた追加のRNA-Seq解析のデータ取得の必要がなくなった。よって、予算を繰り越した。また、出張による成果報告会の回数を減らし、学会の成果報告会の回数を増やした。研究進捗上の必要な打合せはメール及びTV会議での打合せに切り替えた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は、論文成果報告に集中する予定である。英文校閲費用及び論文投稿料に用いる。また、研究分担者との打合せを強化し、計画通り、研究課題を遂行する。
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[Journal Article] Targeted Integration of RNA-Seq and Metabolite Data to Elucidate Curcuminoid Biosynthesis in Four Curcuma Species.2015
Author(s)
Li D, Ono N, Sato T, Sugiura T, Altaf-Ul-Amin M, Ohta D, Suzuki H, Arita M, Tanaka K, Ma Z, Kanaya S
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Journal Title
Plant and Cell Physiology
Volume: 56(5)
Pages: 843-851
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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