2015 Fiscal Year Research-status Report
振動分光によるカルシウム結合タンパク質の構造活性相関の解明
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26410005
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
奈良 雅之 東京医科歯科大学, 教養部, 教授 (90301168)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮川 拓也 東京大学, 農学生命科学研究科, 助教 (50596559)
森井 尚之 国立研究開発法人産業技術総合研究所, その他部局等, 研究員 (80358176)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | カルシウム結合タンパク質 / 赤外分光法 / 合成ペプチドアナログ / 配位構造 / 構造機能相関 / 振動計算 / 同位体ラベル / 凝集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、Ca結合タンパク質ならびにそのCa結合部位の合成ペプチドアナログを用いて、赤外・ラマン分光測定によるカルボシキレート伸縮振動モード解析を行うことにより、金属イオン配位構造と振動スペクトルとの相関を解明することを目的にしている。
（１）タバコ由来のカルモジュリンには３種類のアイソフォーム（NtCaM1, NtCaM3, NtCaM13）が存在し、正常のタバコの葉はNtCaM3を含んでいるが、傷を受けるとNtCaM1やNtCaM13が蓄積されることが知られている。これらのアイソフォームのCa結合ドメイン(Site I～IV)に相当するペプチドアナログをそれぞれ合成して、赤外分光法によるCa配位構造解析を行ったが、一部のペプチドで凝集により金属配位構造形成を阻害される場合が生じた。そのペプチドについて、一部のアミノ酸を置換することにより、金属配位構造形成に関する情報が得られた。
（２）ノンラベル体のペプチドアナログでは、グルタミン酸、アスパラギン酸側鎖COO-基のCOO-逆対称伸縮振動は、Ca2+フリー状態ではそれぞれ1566 cm-1と1585 cm-1付近にバンドが現れる。13Cでラベルすれば、COO-逆対称伸縮振動は約40cm-1に低波数シフトするので、導入したアミノ酸だけの情報が期待できる。トロポニンＣ、パルブアルブミン、プラスティンのカルシウム結合サイトのモデルペプチドで13Cラベル体をグルタミン酸側鎖のカルボキシレート基に導入したところ、他のグルタミン酸と区別できることがわかった。二座配位型のバンドはフリー状態に比べて、バンド強度が強くなるとともに、バンド幅が狭くなった。グルタミン酸残基のモデル系について密度汎関数を用いて構造最適化を行い、振動計算を行ったところ、二座配位構造に伴うピーク位置の挙動が計算で説明できることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質のカルシウム配位構造解析に欠かせない合成ペプチドアナログの赤外スペクトルのデータが一通りそろった状態にあり、分析化学討論会、CABP2015、医用分光学研究会ならびに日本化学会春季年会等で口頭発表を行った。膜タンパク質などの複雑な系のモデルペプチドでは、水に対する溶解度が低いため、液中測定での解析が極めて困難であったが、固体フィルム法を用いることにより、赤外強度を稼ぐことが可能になり、配位構造に関する情報を得ることに成功した。さらに13Cラベル体の合成ペプチドの赤外測定も行われており、カルボキシレート伸縮振動バンド強度ならびにバンド幅に関する新しい知見が得られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度に引き続き、合成ペプチドアナログによる振動分光解析と複雑なタンパク質系の構造活性相関解析を行う。
（１）カルボキシレート基と金属イオンの相互作用を理解するために、振動計算（密度半関数法）によるアスパラギン酸残基の計算化学的考察も合わせて行う。13Cラベル体による赤外スペクトル、ラマンスペクトルの同位体シフトを活用することにより、バンド強度ならびにバンド幅を重要な構造情報として加えて、構造活性相関の解析を行う。
（２）ラマン分光では、溶液中のタンパク質、ペプチドのスペクトルが検出できないことが予想されるので、固体フィルムによる解析、表面増強ラマン分光によるアプローチも行う。低波数振動領域のラマン（テラヘルツラマン）測定は、当研究室の装置だけでは難しかったため、新たに共同研究を開始している。
（３）Ca2+だけなく、様々な金属イオンを用いて、金属イオンによるペプチド、タンパク質のミスフォールディングによる凝集変化をスクリーニングする方法を中赤外領域のスペクトルとラマンスペクトルで確立する。
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