2015 Fiscal Year Research-status Report
ホロ酵素型抗体酵素法によるテーラーメイド人工酵素（抗体酵素）の新機能開拓
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26410184
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
円谷 健 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 准教授 (00372855)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤井 郁雄 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70189984)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 抗体酵素 / 遷移状態アナログ / 抗原 / モノクローナル抗体 / ハイブリドーマ / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
化学反応の遷移状態を模倣した遷移状態アナログをハプテンとして免疫すると，天然酵素と同様の性質を示す抗体酵素が得られる．本研究では，抗原結合部位に人工コファクター結合部位を導入することにより，抗体酵素の新しい機能を創出する．これまでに，様々な抗体酵素が作成されてきたが，その触媒活性は，天然酵素と比べてかなり低いのが現状である．そこで，これまでの抗体酵素の問題点を明らかにし，その解決策として従来とは異なる抗体酵素の作製法（ホロ酵素型抗体酵素法）を開発する．これらの研究は，学術的には酵素の機能発現原理の解明に貢献し，工学的には実用的なテーラーメイド人工酵素の開発につながる．
本年度は，昨年度までに獲得した抗体酵素の触媒機構の詳細について検討すると同時に，抗体酵素の立体構造の解明について，検討した．
(1) 抗体酵素の反応速度パラメータの決定：アルドール反応について触媒活性の観測された抗体酵素を用いて反応速度と基質濃度の関係を調べ，Michaeils-Mentenの式より反応速度パラメータ(kcatおよびKm)を決定した．
(2)抗体酵素の遺伝子クローニング：抗体酵素をコードする遺伝子をマウス抗体遺伝子クローニング用プライマーを用いて増幅させ，抗体発現用ベクターへ組み込みクローニングを行った．得られたベクターを大腸菌に導入し，ELISA法により抗体の発現を確認後，DNAシークエンスにより抗体のアミノ酸配列を推定した．
(3) 抗体酵素のX線結晶解析：抗体を大量培養した後，パパインで消化し，抗体Fab断片を調製した．イオン交換クロマトグラフィーにより同一の等電点を持つ画分を回収し，リン酸ジエステル型ハプテンと混合し，共結晶を作成した．その結果，良好な結晶が得られた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，昨年度までに見いだした，新規抗体酵素反応について，反応速度論的解析を行い詳細を検討した．また，抗体酵素のアミノ酸配列を決定し，ハプテンと抗体との共結晶の作成を検討し，X線結晶解析を行うことができる結晶を得ることに成功した．さらに，新規酸性型コファクターおよびカルボン酸型コファクターを合成した．従って，当初の計画をほぼ順調に遂行することができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに得られた結果を基にして，獲得した抗体酵素の触媒機構を明らかにする．また，新規酸性型コファクターおよびカルボン酸型コファクターを用いた新規反応を検討する．
(1)金属錯体含有コファクターの設計および合成：新規金属錯体コファクターを設計，合成する．金属錯体含有コファクターとしては，水中で安定な金属錯体であることが必須であるため，すでに水中で過酸化水素の共存下で酸化反応触媒として実績のあるRu錯体を設計する．
(2)酸性型コファクターおよびカルボン酸コファクターの合成:新規酸性型コファクター2種類およびカルボン酸型コファクターを合成する．
(3) 抗体酵素の機能解析：新規酸性型コファクターおよびカルボン酸型コファクターを用いて，各種反応を検討し，触媒活性を測定する．触媒反応が観測された抗体について，反応速度論的解析を行い，抗体酵素の機能解析を行う．
(4) 抗体酵素のX線結晶解析：昨年度までに得られた抗体27C1とハプテンとの共結晶について,SPring-8で回折X線を測定し，その結果を解析することにより，27C1とハプテンとの錯体の立体構造を明らかにする．得られた結果をもとに各種，ホロ酵素型抗体酵素で触媒する反応の反応機構を解明する．
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[Presentation] 抗体酵素6D9の触媒活性の向上2015
Author(s)
吉村美穂，武田祐輔，宮本尚樹，円谷 健，藤井郁雄
Organizer
第9回バイオ関連化学シンポジウム
Place of Presentation
熊本大学黒髪キャンパス（熊本県熊本市）
Year and Date
2015-09-10 – 2015-09-12
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