2014 Fiscal Year Research-status Report
高圧力振動分光法を利用した天然変性タンパク質の“機能構造”の予測
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26410187
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
加藤 稔 立命館大学, 薬学部, 教授 (00241258)
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2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 天然変性蛋白質 / 圧力効果 / ラマン分光法 / FTIR法 / ダイヤモンドアンビルセル / αヘリックス / βヘアピン / 水和 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、標的分子なしに、遊離の天然変性蛋白質だけを用いて、“機能構造”（構造形成時のフォールド構造）を実験的に予測する方法を確立することを目標としている。具体的には、以下の3つを研究骨子としている：I．代表的な天然変性蛋白質（pKID, p53, Aβ蛋白）をモデルに用いて、高圧力下でαヘリックスが誘起されるかを実証する。II．新規の２次構造解析法として、高圧力ラマン分光測定法を開拓する。
III．β構造に関する予測原理の確立のための予備研究。
本年度は、上記のIおよびIIを計画に従って推進した。Iでは、実験のモデル分子として、転写因子CREBのpKID, および Aβペプチドをターゲットとした。一番目の研究ターゲットであるpKIDの構造形成後の構造は、ヘリックス･ループ･ヘリックスであり、2本のヘリックス（αA、αB）を有する。αAおよびαBヘリックス、さらに全長へリックを使って実験を進めることが最終目標であるが、本年度はαAペプチドの合成・精製を行った。合成にはFmoc固相合成法を用いた。常圧下での2次構造解析を進め、高圧力下での測定の準備を進めている。2番目のターゲットであるAβ;ペプチドでは部分ペプチドを用いることを想定しており、本年度はAβ(16-22)を対象に予備的な合成・精製を行った。IIでは、ダイクロイックミラーを用いたラマン分光器の利用およびダイヤモンドアンビルセル(DAC)のセッティング条件の変更により、ペプチドの2次構造解析ができるレベルまでのS/Nの向上に成功した。FTIRによる解析に加え、ラマン分光法による2次構造が今後利用可能である。さらに、ラマン分光法では、FTIRでは解析できない、芳香族アミノ酸など側鎖の振動も活用が可能であるため、高圧力下での限られた解析法の拡張に貢献できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度は、I．天然変性蛋白質を用いた機能構造予測法の検証とII．ヘリックス構造検出のための高圧力ラマン分光測定法の開発に関しての準備研究を予定していた。
Iに関しては、pKIDをモデル分子として、単体での圧力効果の研究を、27年度に渡って計画している。26年度では、当初、主にpKIDの全長および2つのヘリックス領域のαAおよびαBペプチドの合成と予備実験を予定していたが、αAペプチドの合成までにとどまった。ペプチド合成・精製では、配列によっては手間がかかる場合があり、やむを得ない側面もある。現在、予備実験に必要な量は取得できており、αBペプチドの合成とともに予備実験を進めている。
IIに関しては、ハーフミラーを用いたラマン分光器からのダイクロイックミラーを採用したラマン分光器に変更するとともに、DAC用のガスケットの肉厚を大きくすることにより、感度の改善に成功した。FTIRと比べS/Nはよくないのは原理的にやむを得ないところではあるが、サンプル濃度等のその他の実験条件の工夫により、2次構造解析への応用の見通しはたった。さらに、ラマン分光法の優位な特徴であるチロシンやトリプトファンの側鎖由来のラマン散乱の測定が可能であることも確認できた。ただし、ダイヤモンドは1332 cm-1に強いピークがあり、これとオーバーラップする領域は観測できなかった。これらのテスト測定は、当初29年度に予定していたβヘアピンペプチドを用いた。
以上のように、Iに関しては、当初計画から遅れているが、IIに関しては予定以上に推移しており、全体としては順調だった。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度に関しても申請当初の研究計画に沿って研究を推進する。計画では、前年度と同様に以下2つのサブーマ：I．天然変性蛋白質を用いた機能構造予測法の検証とII．ヘリックス構造検出のための高圧力ラマン分光測定法の開発、を柱とする。ただし、前年度ではIのテーマの進捗状況がIIと比較して相当遅れたため、この点にも十分考慮して、研究を進める。Iで取り扱うモデル分子は、pKID以外も想定しており、pKIDの進捗状況も勘案して、並行して研究を推進する。ペプチド合成の効率は配列に強く依存するため、今年度は一つのペプチドに固執せず、予備実験を通して、合成の優先順位を臨機応変に検討・対応していく。
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| Causes of Carryover |
2月－3月の期間は研究室の引っ越しがあり、研究実施が当初計画より遅延した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度、特に年度末期において、ペプチドの合成・精製に関しての計画が未達部分があった。未達分のペプチド合成用試薬の追加購入に充てる。
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