2015 Fiscal Year Research-status Report
高圧力振動分光法を利用した天然変性タンパク質の“機能構造”の予測
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26410187
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
加藤 稔 立命館大学, 薬学部, 教授 (00241258)
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2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 天然変性蛋白質 / 圧力効果 / FTIR法 / ラマン分光法 / ダイヤモンドアンビルセル / αヘリックス / βヘアピン / 水和 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、標的分子なしに、遊離の天然変性蛋白質だけを用いて、“機能構造”（構造形成時のフォールド構造）を実験的に予測する方法を確立するめざし、以下3つの課題を設定している：1．代表的な天然変性蛋白質をモデルに用いての圧力誘起αヘリックス形成の実証、2．新規の２次構造解析法としての高圧力ラマン分光測定法の開発、3．β構造に関する予測原理の確立のための予備研究。
課題1では、転写因子CREBのpKID, および Aβペプチドを対象とした。pKIDの構造形成後の構造は、ヘリックス･ループ･ヘリックスであり、2本のヘリックス（αA、αB）を有するが、本年度は昨年合成に成功したαAペプチドの基礎的な測定実験を行った。はじめに、ヘリックス誘起剤であるトリフルオロエタノール(TFE)の添加実験を行い、コイル-ヘリックス転移に及ぼす濃度化から転移のギブズエネルギー変化を求めることに成功した。このような基礎データに関する研究はこれまでほとんど報告例がない。さらに、高圧FTIR法を用いて、高圧下での二次構造測定を実施した。Amide I’モード領域のスペクトルから、加圧に伴いヘリックスが増加する傾向が観測された。Aβペプチドに関しては昨年度と同様にAβ(16-22)を対象に合成・精製を行ったが、分光測定ができるまでの十分な試料量は得られていない。
課題2に関しては、昨年度までに、高濃度（15mg/ml程度）のサンプルで、ペプチドの2次構造解析ができることが確認できた。本年度は、課題3の課題とも関連する4つのトリプトファンを疎水性コアとして有するβヘアピンペプチド(Trpzip4)を研究対象とした。ラマンスペクトルの優位性の一つに、芳香族アミノ酸の測定が可能である点であり、トリプトファン側鎖のラマン測定を中心に研究を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題1に関しては、昨年度までにpKIDのαAペプチドの合成・精製を行った。本年度は上記概要の通り、αAペプチドの基礎データ（コイル-ヘリックス転移のギブズエネルギー変化）の決定、および高圧FTIR法を用いて、高圧下での二次構造測定に成功した。しかしながら、より詳細な実験およびαBペプチド、αA+αBペプチドの合成・測定実験までは到達できていない。Aβペプチドに関しても、概要で述べた通り、精製段階で止まっている。課題1の目標達成には、一つの例だけはなく、複数の例で、圧力誘起ヘリックス形成を実験的に確認することが必要である。
課題2に関しては、1年目に測定技術に関しての基本的な問題は解決した。本年度からサンプル測定を開始しており、これまでの進捗状況は計画通りであるといえる。サンプルもβヘアピンペプチドを用いたことから、実験の成果は、課題3の計画にも寄与することが期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に関しても基本的に申請当初の計画に沿って研究を推進する。課題1に関しては、一部当初の計画より遅れている。計画が遅れた原因は、ペプチドの固相合成は順調に行えたが、精製段階で、サンプル量が劇的に減少してしまったことにある。FTIRの測定では、合成過程で残存するトリフルオロ酢酸(TFA)の吸収バンドが、目的ペプチドのアミドIバンドとオーバーラップする。サンプルからTFAを取り除くために、HPLCによる分収後、さらに塩酸処理して凍結乾燥する過程が複数回必要とする。しかしながら、低分子量のペプチドの場合、この操作により回収率が著しく低下する。当初計画では、pKIDにおいては合成が短時間で行える断片ペプチド（αAペプチドおよびαBペプチド）を最初の対象分子とし、その後αA+αBペプチドを行う予定であったが、より分子量の大きいαA+αBペプチドの方が、精製段階のサンプ損失が少ないことが予想される。28年度はαA+αBペプチドを優先して、その後断片ペプチドへと研究を進めることとする。Aβペプチドの低い回収率の原因もpKIDと同様に考えられる。当初の予定の順番を変更して、より鎖長の長い変異体を研究対象とすることを検討する。
上記のように、対象分子をより分子量の大きいものに変更して研究を進めるが、それでも難しい場合に備えて、上記のペプチド以外で、すでに合成・精製実績のある他のペプチドやタンパク質も研究対象として検討する。
課題2に関しては、測定技術の確立の点において、現段階では順調に推移している。28年度は、課題3も視野に入れ、実際のペプチドの測定および解析に重点を当てる。27年度にテスト測定に用いたTrpzip4の測定・解析をさらに進めると同時に、その変異体（一部のTrpをTyr, Valに置換したもの）も対象とする。
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| Causes of Carryover |
計画的に使用した結果、わずかな繰り越し額（998円）が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
消耗品（試薬）の購入の一部に充当する。
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