2014 Fiscal Year Research-status Report
Ｐａｒｋｉｎの新規基質ＩＰＡＳの解析によるパーキンソン病発症メカニズムの解明
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26430051
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
鳥居 暁 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 講師 (10444001)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 神経変性疾患 / パーキンソン病 / PINK1 / Parkin / MPTP / IPAS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、PINK1-Parkin経路の新規基質として見出したタンパク質IPASの解析を行うことによりパーキンソン病発症メカニズムの解明に繋げることと、これらの神経変性疾患に関わるオートファジーの新規分子シグナル機構の解明を行うことである。本年度においては、まずミトコンドリアのIPASがCCCPによって活性化されたPINK1-Parkin経路によってどのように制御されるかを解析した。IPASとParkinの結合を免疫沈降実験で解析したところ、両者の結合がミトコンドリア脱分極剤であるCCCP依存的に起こることを見出した。さらにPINK1の基質にもIPASがなる可能性を考え、PINK1とIPASの結合も解析したところ同様にCCCP依存的に結合することがわかった。さらにPINK1によるIPASのリン酸化を、Phos-tagとPINK1 siRNAを用いて解析したところ、IPASが複数のセリンかスレオニンでPINK1依存的にリン酸化されることを見出した。IPASノックアウトマウスの作製は理化学研究所との共同研究によって完了した。ノックアウトマウスはメンデルの法則に準拠して生まれ成長しており胎生致死は起きなかった。MPTP投与を上記のマウスに行い、通常マウスとIPASノックアウトマウスでの影響の差を中脳黒質ドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるチロシン水酸化酵素の免疫染色で解析した結果、IPASノックアウトマウスではMPTPによる神経細胞の減少が抑えられることがわかった。これらの結果からIPASがPINK1-Parkin経路によってリン酸化とユビキチン化を受けること、さらにMPTPによる神経細胞死においてIPASが関与することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
IPASとPINK1-Parkin経路の制御機構がリン酸化依存的であることが解明され、大きく進展したとともに、最大の目的であるMPTPにおける中脳黒質の神経細胞死にIPASが関与していることが見出されたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
PINK1によってリン酸化されるIPASのセリンもしくはスレオニン残基を特定し、その変異体を用いてPINK1によるリン酸がIPASのParkinへの結合に影響を与えないか解析する。結果的にこのIPAS非リン酸化変異体がPINK1-Parkin経路による分解抵抗性を持つことを期待している。IPASのミトコンドリア特異的な分解をミトコンドリアの分画実験によって解析し、ParkinをsiRNAによって減少させた際の、CCCP依存的なIPASユビキチン化の減少が引き起こされるかを解析する。最終的にPINK1-Parkin経路の活性化によってIPASによるアポトーシスが抑制されることを調べることで、生理機能におけるPINK1-Parkin経路のIPAS制御の重要性を証明する。
マウスIPASの抗体を用いて、MPTP投与マウスにおけるIPASの発現誘導をより詳しく解析する。ミトコンドリアマーカーMitoGreenもしくはTom20抗体を用いることで、内在性のIPASがミトコンドリアに局在することを明らかにする。
ヒトパーキンソン病の患者のより多くの症例（組織サンプル）を用いて中脳ドーパミン作動性神経細胞におけるIPASの挙動を解析する。IPASの発現の有無とその細胞種、αシヌクレイン抗体を用いたレビー小体での共局在、ミトコンドリアや核の異常（アポトーシス）、チロシン水酸化酵素の発現減少等を検討する。
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Research Products
(1 results)
