2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
26430075
|
|---|
| Research Institution | Keio University |
|---|
Principal Investigator |
久保 健一郎 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20348791)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
|
| Keywords | リーリン / 接着分子 / Nカドヘリン / 大脳皮質 / 原子間力顕微鏡 / 発生 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、細胞間の接着に関わる分子のうち、引き続きNカドヘリンに注目して、Nカドヘリンがリーリンによってどのように制御されて細胞凝集を生じるのかを解析した。発生中マウス脳内に、子宮内胎児電気穿孔法によるリーリン発現プラスミドを導入してリーリンの強制発現を行うと、特徴的な神経細胞の凝集構造がリーリンによって形成される。前年度までに、凝集構造が形成される際に、ワイルトダイプのNカドヘリンやドミナントネガティブ体のNカドヘリンの強制発現、RNAiを用いたNカドヘリンのノックダウンを組み合わせて行った結果、Nカドヘリンがリーリンによる神経細胞の凝集構造の形成に必要であることが示唆されていた。本年度は、この現象の特異性を検証するために、ノックダウン抵抗性のNカドヘリンを作成し、これを用いたレスキュー実験を行ったところ、RNAiを用いたNカドヘリンのノックダウンにノックダウン抵抗性のNカドヘリンを共発現することでリーリンによる神経細胞の凝集構造が形成された。これによって、Nカドヘリンがリーリンによる神経細胞の凝集構造の形成に必要であることが明らかになった。
また、神経細胞上のNカドヘリンがリーリン刺激の前後でどのような制御を受けるのかを確認するため、リーリン刺激の前後でNカドヘリンへの結合の変化が起こるかどうか、原子間力顕微鏡を用いて解析したところ、培養細胞表面のNカドヘリン結合力がリーリン刺激によって強まることが明らかになった。このNカドヘリン結合力を変化させる細胞内カスケードや、Nカドヘリン以外の分子がリーリンの下流で細胞接着を制御しているかどうかを明らかにするため、子宮内胎児電気穿孔法を用いたリーリンによる神経細胞の凝集系を用いて、その候補分子の探索や機能解析を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画で３年目の目標にあげた項目について解析が進んだほか、当初は想定していなかった原子間力顕微鏡を用いた解析が効果的に進んでおり、リーリン刺激によって培養細胞表面のNカドヘリン結合力が強まることが明らかになってきている。Nカドヘリン結合力を変化させる細胞内カスケードや、Nカドヘリン以外の分子がリーリンの下流で細胞接着を制御しているかどうかについても、複数の新規候補分子について解析を進めている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
Nカドヘリン以外の分子がリーリンの下流で細胞接着を制御しているかどうかを明らかにするため、NカドヘリンやNカドヘリン以外の候補分子の機能解析を、神経細胞の凝集構造を用いた生体内解析系に加えて、分散培養系と原子間力顕微鏡を用いて行う。加えて、Nカドヘリン結合力を変化させる細胞内カスケードについても同様に解析を行い、明らかにしていく。
|
| Causes of Carryover |
当初は購入を予定していた動物に代えて、一部は研究室内で繁殖した動物を用いたため、実験動物にかかる費用が減少したほか、効率的な消耗品の購入と使用により、物品費が減少した。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
生体内解析系に加えて、分散培養系を用いた解析を進める際に必要な培養器具や試薬を十分量用意して分子経路についての解析を進める。さらに、生体内解析系での解析に必要な実験動物数は当初の見積もりよりも余裕を持って確保し、条件検討や詳細な解析を進める。
|
