2014 Fiscal Year Research-status Report
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26450123
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
関 光 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (30392004)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | トリテルペノイド / 生合成酵素遺伝子 / 発現制御 / プロモーター / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、植物トリテルペノイドの代表格であり、漢方原料植物であるマメ科カンゾウ（甘草）が特異的に生産するグリチルリチンおよびマメ科植物全般が生産するソヤサポニンに注目し、申請者らが先に同定している、これらの生合成酵素遺伝子の発現制御に関わるシス因子および転写制御因子の同定を目的とする。
平成２６年度は、１）グリチルリチン「低含量」および「高含量」系統それぞれからの生合成遺伝子プロモーターの単離と配列比較、２）プロモーター::GUSレポーター導入シロイヌナズナを用いたプロモーター活性評価、３）カンゾウおよびモデルマメ科植物タルウマゴヤシのトランスクリプトームデータを用いた候補転写因子の選抜を進め、さらに、４）レポーター／エフェクターコンストラクトのコ・トランスフェクションによる転写因子機能解析に着手した。
グリチルリチン「高」含量系統とグリチルリチン「低」含量系統における遺伝子発現プロファイルを比較した結果、グリチルリチン生合成に関わる3つの酵素（β-アミリン合成酵素、β-アミリン11位酸化酵素、およびβ-アミリン30位酸化酵素）遺伝子の発現量はグリチルリチン「高」含量系統において顕著に高いことを見出した。β-アミリン合成酵素およびβ-アミリン11位酸化酵素（CYP88D6）の2遺伝子について、両系統からプロモーター断片を単離した。系統間でプロモーター配列に多型が見られたが、これらのプロモーター断片をGUSレポーター遺伝子に連結したコンストラクトを作成しプロモーター活性を比較したところ、系統間でのプロモーターGUSの発現に顕著な量的・質的な差は認められなかった。このことから、系統間での生合成遺伝子の発現レベルの違いは、プロモーター配列中の多型よりも両遺伝子の発現制御にかかわる転写制御因子の発現レベルの違いに起因する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
グリチルリチン「低含量」および「高含量」系統それぞれからの生合成遺伝子プロモーターの単離と配列比較、ならびに、GUSレポーター遺伝子を用いたプロモーター活性の解析により、系統間での生合成遺伝子の発現レベルの違いは、プロモーター配列中の多型よりも両遺伝子の発現制御にかかわる転写制御因子の発現レベルの違いに起因する可能性を示唆することができた。
そこで、これら生合成遺伝子の転写制御にかかわる転写制御因子の探索を進めた。マメ科モデル植物のタルウマゴヤシの培養細胞を用いた実験では、トリテルペノイド生合成遺伝子の発現量がメチルジャスモン酸を処理した場合に上昇し、一方、酵母抽出物エリシターを処理すると低下もしくは変動しないことが知られている。そこで、タルウマゴヤシの公開トランスクリプトームデータから、このような発現パターンを示す転写因子を8種絞り込み機能解析に着手した。同時に、カンゾウのデータベースを用いてホモロジー検索を行い、上記の各タルウマゴヤシ転写因子に対して高い相同性を示す候補転写因子を計8種選抜した。それらについて、cDNA単離ならびに各候補転写因子を高発現するためのエフェクターコンストラクトを作製し、タバコBY-2培養細胞を用いてレポーター／エフェクターコンストラクトのコ・トランスフェクションによる転写因子機能解析に着手した。
これまでの予備的な試験において、β-アミリン合成酵素遺伝子およびソヤサポニン生合成に関わるCYP93E3遺伝子プロモーターの活性を上昇させる２種の転写因子を既に見出していることから、研究は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２６年度内に単離した８種の候補転写因子について、タバコBY-2培養細胞由来プロトプラストを用いた転写因子機能解析を継続し、グリチルリチンおよびソヤサポニン生合成酵素遺伝子プロモーターに対する転写活性化能を詳細に評価するとともに、プロモーター上の転写因子の結合部位を同定すべく、プロモーターのデリーション／変異導入解析を行う。
平行して、転写活性化能が確認できた転写因子を高発現する、あるいは発現抑制したカンゾウ組織の作出を目指して、アグロバクテリウム法による遺伝子導入を行うための転写因子の高発現および発現抑制バイナリーコンストラクトの作成と形質転換カンゾウ毛状根の作出条件の設定に着手する。
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| Causes of Carryover |
リアルタイムPCRシステムおよび、それに係る消耗品の購入が当初の想定よりも低い価格で購入できたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
リアルタイムPCRシステムおよび、それに係る消耗品の追加購入にあてる。
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