2014 Fiscal Year Research-status Report
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26450291
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
藪 健史 日本大学, 生物資源科学部, 研究員 (00551756)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山下 倫明 独立行政法人水産総合研究センター, その他部局等, グループ長 (80344323)
今村 伸太朗 独立行政法人水産総合研究センター, その他部局等, 主任研究員 (80510007)
司馬 肇(張培淦) 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (90256834)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 水産化学 / セラミド / アポトーシス / ストレス / セラミド結合性タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
スフィンゴ脂質セラミドは，熱や紫外線，化学物質等のストレス，TNFα，インターフェロンγ，Fas リガンドなどの炎症性サイトカインの刺激に応答して細胞内で生成され，神経系，血管系形成，免疫系および性分化におけるアポトーシスに関与する。しかしながら，セラミドがアポトーシスを誘導する機序は依然不明である。そこで，本研究では，セラミドを輸送し，カスパーゼ前駆体を活性化して，アポトーシスを誘導する未知分子を単離する。この分子が，セラミドの細胞内分布・局在性を決定し，セラミドのセカンドメッセンジャーとしての作用を促進することを，バイオアッセイによって解析する。
アポトソームは，ミトコンドリア崩壊により放出されたチトクロームC と細胞質に局在するApaf-1 とが会合して形成される多量体（分子量680K 以上）である。アポトソームは，前駆カスパーゼ９をリクルートして，カスパーゼ９が活性化し，カスパーゼ３などの下流のカスパーゼを活性化し，アポトーシスが誘導されると考えられている。よって，本年度は，ヒト培養細胞へストレスを暴露してアポトソーム形成を観察し，分離・精製法を確立した。そこで，ZE細胞およびJurkat細胞へUVストレスを暴露して，細胞を破砕して除核後，超遠心法によって細胞質画分を調整した。ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画し，ウエスタンブロット解析よりカスパーゼ９活性化やチトクロームC およびカスパーゼ９のタンパク質発現をを調べた。すなわち，アポトソームの分離・精製できる試験条件を決定した。また，アポトソーム画分のおけるセラミド含量を測定した結果，アポトソーム画分にセラミドが含有することを突き止めた。
以上のことから，アポトーシス誘導時においてセラミドが細胞質画分，とくにアポトソーム画分にセラミドが分布することを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アポトソームの分離・精製できる試験条件を決定したこと。ストレス応答に関わるセラミドがアポトソーム画分に分布することを突き止めたこと。これらのことから，次年度以降から，セラミド結合性タンパク質の精製に取り組むことが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究として，セラミドカラムを作製後，細胞質画分あるいはアポトソーム画分からアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーによってセラミド結合性タンパク質を精製する。セラミド結合分子は，FPLCまたはSDS-PAGEで分離後，質量分析やウエスタンブロット解析によりタンパク質の組成を同定するとともに，脂質化やリン酸化などの化学修飾も調べる。
上記の作業仮設が成立した場合，細胞におけるセラミド結合分子の役割を調べるため，セラミド結合分子遺伝子をクローン化して，本遺伝子を導入した発現ベクターを作製して，培養細胞へ導入し本分子を過剰発現させて，アポトーシス誘導能やカスパーゼ活性を調べる。
以上の研究計画に基づき，次年度については，セラミド結合分子の性質や細胞内における役割を調べる。
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| Causes of Carryover |
年度末に，発注した試薬が輸入品であるため，納品が遅れ次年度へ持ち越しとなった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
セラミド結合性タンパク質の性質を調べるため，次年度使用額27,867円を試薬代として使用する。
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Research Products
(1 results)
