2015 Fiscal Year Research-status Report
精子先体形成におけるアクチン細胞骨格のダイナミクス
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26450499
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
兼森 芳紀 筑波大学, 生命環境系, 助教 (40529088)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | マウス / 先体 / 精子形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳動物の精子頭部には、先体とよばれる消化酵素に富んだ特殊な細胞小器官がある。先体は、受精過程での精子の卵子卵丘細胞層や透明帯の通過を助けるはたらきをもつ。ACRBPは、セリンプロテアーゼAcrosinと結合する先体内タンパク質であり、マウスでは選択的スプライシングによる2種のバリアントACRBP-WとACRBP-V5が発現している。最近のわれわれの研究から、ACRBP-WとACRBP-V5の両方を欠損させたマウスでは、精子形成過程で先体顆粒の凝集および先体の伸長化ががおこらずに、精子先体が断片化することが見い出された。すなわち、ACRBPは精子先体形成で重要な役割をもつことが明らかになった。本研究計画では、細胞骨格因子の視点からこのACRBP欠損による先体形成異常の原因を追究することを目的としている。平成27年度に得られた研究成果は以下の3つである。
1.ACRBP欠損マウスについて解析した論文を投稿した。
2.精子先体と核を接着する構造物Acroplaxomeに着目し、免疫染色法によりACRBP欠損精細胞でのチューブリンやアクチンフィラメントの異常局在を観察した。
3.ACRBPとの結合因子を同定するため、精巣抽出液を用いた免疫沈降後に共沈物をLC/MS/MSで解析した。ACRBP結合因子の候補タンパク質として、チューブリンやプロテアソームのサブユニットを同定した。免疫染色実験から、これらのタンパク質は精子先体に局在することも判明した。平成28年度は引き続きこれらのタンパク質の機能解析を進めていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画として掲げていたACRBP欠損マウスの解析結果を論文投稿できた点、およびACRBP結合因子としてチューブリンとプロテアソームサブユニットを同定した点について一定の成果を上げており、おおむね予定通り進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の実験計画は、以下の2点に絞り進めていく。
1.Lifeactマウスの作製
精子形成を細胞骨格の視点からモニターするため、Lifeact-GFPのプラスミドを受精卵に導入し、トランスジェニックマウスを作製する。Lifeactマウスの精巣切片を用いて、精子先体形成でのアクチンフィラメントを共焦点レーザー顕微鏡で観察する。得られたイメージ画像をもとに３次元構築や数値化させた後に立体シミュレーション解析も行う。
2.ACRBP結合因子の解析
ACRBP結合タンパク質の機能解析のため、遺伝子欠損マウスの作製を行う。作製はCRISPR/Casシステム(Wang et al. Cell 2013)を用いて遺伝子座位による方法を利用する。欠損マウスの先体形成過程を調べることで、ACRBPと細胞骨格因子の関連性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
平成27年度に予定していた遺伝子改変マウスの作製と解析を見送ったため。
それに伴い、マウス維持費や消耗品の使用額が大幅に削減された。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
差引額分は、マウスの作製や維持費、タンパク質精製カラムの購入に使用する予定である。
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