常活性型蛋白質の分解不活化を誘導する新規E3ユビキチンリガーゼの生理機能の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460068
• Research Institution: Ohu University
• Principal Investigator: 西屋 禎 奥羽大学, 薬学部, 教授 (80399831)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: ECS(SPSB) / iNOS / Nrf3 / NQO1

Outline of Annual Research Achievements

ECS(SPSB1)、 ECS(SPSB2)、およびECS(SPSB4)（ECS(SPSB1,2,4)）の個体レベルにおける生理機能を明らかにするために，ECS(SPSB1,2,4)の機能を抑制するタンパク質（誘導型NO合成酵素（iNOS）のN末1～118アミノ酸部分；ECS(SPSB1,2,4)インヒビター）を可逆的にマウスに発現させるためのTetシステムの構築を進めた。発現系の機能確認として、マウスマクロファージ細胞株のRAW264.7細胞にTet-ONシステムを導入することにした。導入の第一段階として，pRevTet-ONベクターをRAW264.7細胞に導入し，得られたRAW264.7-TetON細胞に，第2段階としてpRevTRE-iNOSベクターを導入した．こうして得られたRAW264.7-TetON-iNOS細胞にドキシサイクリン（DOX）を付加すると、24時間後にはiNOSがDOX未処理の細胞よりも優位に発現することを確認した。しかしながら、DOX未処理の細胞においても無視できないレベルのiNOSの発現（リーク）が確認された。したがって、このリークをできる限り少なくするための何らかの方策が必要であることがわかった。
ECS(SPSB3)による転写制御因子Nrf3の機能調節についても検討した。Hela細胞にNrf3を過剰発現させるとNQO1の発現が抑制されるが、SPSB3を共発現させると、NQO1の発現が回復した。この結果から、SPSB3はNrf3によるNQO1の転写抑制機能を負に制御することが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度はECS(SPSB3)による転写制御因子Nrf3の機能調節に関する新知見を得ることができたが、今年度の主要目的であったECS(SPSB1,2,4)インヒビターをTet-ONシステムを用いて可逆的に発現させる系の構築が未完了であるため。

Strategy for Future Research Activity

① ECS(SPSB3)による転写制御因子Nrf3の機能抑制のメカニズムを明らかにする。具体的には、Nrf3の小胞体から核への移行、核内でのNrf3とsmall Mafとの二量体形成、およびこの二量体のプロモーターへの結合に対するSPSB3の影響を検討する。
② Tet-OFFシステムの再検討を含めたTetシステムによるECS(SPSB1,2,4)インヒビターのマウスにおける可逆的発現系の構築を目指す。