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2015 Fiscal Year Research-status Report

shRNAライブラリーにより同定した新規細胞死実行因子の機能解析

Research Project

Project/Area Number 26460075
Research InstitutionKitasato University

Principal Investigator

今井 浩孝  北里大学, 薬学部, 教授 (50255361)

Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsGPx4 / フェロトーシス / ビタミンE / shRNAライブラリー / タモキシフェン / GFP / 細胞内局在
Outline of Annual Research Achievements

本年度は、網羅的shRNAのスクリーニングにより明らかにしたGPx4欠損細胞死の実行遺伝子(ノックダウンにより細胞死が抑制できた遺伝子群)44遺伝子のうち、昨年度得られたcDNAがクローニングできた19遺伝子について,機能や発現部位が報告されていないものがほとんどであったため、脂質酸化依存的新規細胞死(タモキシフェン添加)の際に細胞内の分布が変化するような遺伝子はないか、また脂質酸化あるいはその代謝に関連しそうな膜画分に分布する遺伝子が存在しないかについて主に検討を行った。まず19遺伝子すべてについて、GFPのN末端およびC末端にそれぞれのタンパク質を融合させたコンストラクトを作成し、タモキシフェン誘導型GPx4欠損MEF細胞にリポフェクトアミンを用いて導入し、タモキシフェンを添加した0時間から24時間ごとに72時間までオールインワン顕微鏡で観察した。この19遺伝子には再構成実験で再現性があり細胞死実行因子として確定させた6遺伝子もすべて含まれる。このうち、タモキシフェン添加前の細胞内での発現分布を調べたところ,2つの遺伝子が細胞膜、細胞膜あるいは小胞体に存在する遺伝子であり、1つの遺伝子は、核および核小体に存在していた。このうち再構成で確定した細胞死実行遺伝子の一つが細胞膜蛋白質であったことは興味深い。そのほかの16遺伝子については、すべて細胞質全体が染まっており、細胞質に存在するタンパク質であることが示唆された。次にタモキシフェン添加24時間後、48時間後、72時間後のGFP蛍光像の観察により細胞内分布の変化が起きるか調べたが、残念ながら19タンパク質は脂質酸化に応じて移動が観察されたタンパク質はなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、昨年度のノックダウンによる解析から明らかにしたGPx4欠損細胞死実行遺伝子のcDNAのクローニングをすすめ、再導入で実行因子として確定できた6個を含む19遺伝子について、GFP融合タンパク質をすべて作成し、そのタンパク質の細胞内分布を明らかにすると共に、細胞死の過程で脂質酸化に応じて細胞内の分布を変化させる遺伝子があるのかについてまで解析できた。残念なことに細胞内の分布を移動させるタンパク質は見つからなかったが、細胞膜や核内に存在する遺伝子が3つあり、そのうち一つは既に脂質酸化依存的細胞死実行因子として確定できた遺伝子であった点は大きな成果である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度は本実験をまとめる上でも、少なくともcDNAがクローニングできた遺伝子群については、再構成実験、ノックダウン細胞を用いた細胞死抑制部位の同定、具体的には脂質酸化の上流で機能しているのか、MEK-ERKの上流で機能しているのか、下流で機能しているのかについて明らかにし、一連の実験で明らかにした遺伝子の分布、機能部位の表の完成を目指す。できれば再構成系で確定できた6遺伝子に関してはリコンビナントタンパク質の発現系を作成し,機能解析を行いたいと考えている。

  • Research Products

    (21 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 6 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Role of Glutathione Peroxidase 4 in Glutamate-induced Oxytosis in the Retina.2015

    • Author(s)
      Sakai, O., Uchida, T., Roggia, MF., Imai, H., Ueta, T., Amano, S.
    • Journal Title

      PLoS One

      Volume: 10 Pages: 該当なし

    • DOI

      10.137/journal.pone.0130467 eCollection

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Nrf2 up-regulates the induction of acidic sphingomyelinase by electrophiles.2015

    • Author(s)
      Kumagai, T., Ishino, T., Yajima, Y., Nakagawa, Y., Imai, H.
    • Journal Title

      Journal of Biochem (Tokyo)

      Volume: 158 Pages: 127-137

    • DOI

      10.1093/jb/mvv030.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] フェロトーシス-脂質酸化依存的新規細胞死―2015

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Journal Title

      臨床免疫・アレルギー科

      Volume: 63 Pages: 406-414

  • [Presentation] 脂質酸化依存的新規細胞死実行因子Lipo-1遺伝子のスクリーニング2016

    • Author(s)
      小林祈、松川ふみ、松岡正城、今井浩孝
    • Organizer
      日本薬学会第136年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜 (神奈川県 横浜市)
    • Year and Date
      2016-03-29
  • [Presentation] PHGPx欠損により誘導される新規細胞死に対するスフィンゴミエリン合成酵素2(SMS2)の機能解析2016

    • Author(s)
      部坂由衣、大矢梨里香、木下裕香子、原田晋作、大川信子、熊谷剛、今井浩孝
    • Organizer
      日本薬学会第136年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜 (神奈川県 横浜市)
    • Year and Date
      2016-03-29
  • [Presentation] GPx4欠損によるフェロトーシス様新規細胞死の分子メカニズム2016

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Organizer
      日本薬学会第136年会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜 (神奈川県 横浜市)
    • Year and Date
      2016-03-28
    • Invited
  • [Presentation] PHGPxにより制御される脂質ヒドロペルオキシド依存的新規細胞死2015

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Organizer
      第30回日本酸化ストレス学会関東支部会
    • Place of Presentation
      東海大学代々木キャンパス( 東京都 渋谷区)
    • Year and Date
      2015-12-01
    • Invited
  • [Presentation] 脂質酸化依存的新規細胞死(フェロトーシス)と疾患2015

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Organizer
      第31回Wakoワークショップ 細胞死のNew Horizon 細胞死研究の先に見えてきたもの
    • Place of Presentation
      東京コンファレンスセンター・品川 ( 東京都 品川区)
    • Year and Date
      2015-11-04
    • Invited
  • [Presentation] Ferroptosis regulator GPx4 or Vitamin E in heart prevents cardio sudden death in mice2015

    • Author(s)
      Imai, H., Koumura, T. and Matsuoka, M.
    • Organizer
      Japan Australia Meeting on Cell Death
    • Place of Presentation
      Melbourne (Australia)
    • Year and Date
      2015-10-22
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Suppession of generation of phospholipid hydroperoxide in heart by vitamin or GPx4 prevents cardio sudden death in mice2015

    • Author(s)
      Imai, H., Matsuoka, M., Sakamoto, T., Koumura, T. and Kumagai, T.
    • Organizer
      56th International Conference on the Bioscience of Lipids (ICBL)
    • Place of Presentation
      Puerto Iguazu (Argentina)
    • Year and Date
      2015-09-25
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ビタミンEにより制御される新規フェロトーシス様細胞死と疾患2015

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Organizer
      フォーラム2015 衛生薬学・環境トキシコロジー
    • Place of Presentation
      神戸学院大学薬学部( 兵庫県 神戸市)
    • Year and Date
      2015-09-17
    • Invited
  • [Presentation] スフィンゴミエリン合成酵素2(SMS2)は過酸化脂質依存的な新規細胞死を抑制する2015

    • Author(s)
      熊谷剛、大矢梨里香、木下裕香子、原田晋作、大川信子、今井浩孝
    • Organizer
      フォーラム2015 衛生薬学・環境トキシコロジー
    • Place of Presentation
      神戸学院大学薬学部 (兵庫県 神戸市)
    • Year and Date
      2015-09-17
  • [Presentation] ビタミンEにより制御されるフェロトーシス様新規細胞死の抑制因子SMS2の解析2015

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Organizer
      第18回Vitamin E Update Forum
    • Place of Presentation
      如水会館 (東京 千代田区)
    • Year and Date
      2015-08-28
    • Invited
  • [Presentation] 脂質酸化依存的新規細胞死実行因子の探索とGFP融合タンパク質を用いた局在とその変動の解析2015

    • Author(s)
      小林祈、松岡正城、今井浩孝
    • Organizer
      第28回北里大学バイオサイエンスフォーラム
    • Place of Presentation
      北里大学相模原キャンパスL2 ( 神奈川県 相模原市)
    • Year and Date
      2015-08-06
  • [Presentation] スフィンゴミエリン合成酵素2(SMS2)はPHGPx欠損により誘導される新規細胞死を抑制する2015

    • Author(s)
      熊谷剛、大矢梨里香、木下裕香子、原田晋作、大川信子、今井浩孝
    • Organizer
      第68回日本酸化ストレス学会学術集会
    • Place of Presentation
      かごしま県民交流センター (鹿児島県 鹿児島市)
    • Year and Date
      2015-06-11
  • [Presentation] フェロトーシス様脂質酸化依存的新規細胞死のシグナル伝達経路の解析2015

    • Author(s)
      小林祈、松川ふみ、原田晋作、松岡正城、今井浩孝
    • Organizer
      日本ビタミン学会第67回大会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂 ( 奈良県 奈良市)
    • Year and Date
      2015-06-05
  • [Presentation] スフィンゴミエリン合成酵素2(SMS2)はPHGPx欠損による新規細胞死を抑制する2015

    • Author(s)
      持田俊也、大矢梨里香、佐藤智美、木下裕香子、原田晋作、大川信子、熊谷剛、今井浩孝
    • Organizer
      日本ビタミン学会第67回大会
    • Place of Presentation
      奈良県新公会堂 ( 奈良県 奈良市)
    • Year and Date
      2015-06-05
  • [Presentation] 網羅的shRNAライブラリーを用いた脂質酸化依存的な新規細胞死実行因子の探索2015

    • Author(s)
      松岡正城、松川ふみ、小林祈、新井洋由、今井浩孝
    • Organizer
      第57回日本脂質生化学会
    • Place of Presentation
      一橋大学一橋講堂 (東京都 千代田区)
    • Year and Date
      2015-05-29
  • [Presentation] Novel lipid peroxidation dependent cell death (Ferroptosis like cell death) by deficiency of GPx42015

    • Author(s)
      Imai, H
    • Organizer
      2015 Spring Annual Convention of Pharmaceutical Society of Korea
    • Place of Presentation
      OSONG (Korea)
    • Year and Date
      2015-04-24
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Book] 疾患モデルの作成と利用―脂質代謝異常と関連疾患<下巻> 第6節 過酸化リン脂質消去酵素2015

    • Author(s)
      今井浩孝
    • Total Pages
      413 (331-339)
    • Publisher
      (株)エル・アイ・シー
  • [Remarks] 北里大学薬学部衛生化学教室ホームページ

    • URL

      http://www.pharm.kitasato-u.ac.jp/eisei/eisei/Home.html

URL: 

Published: 2017-01-06  

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