2016 Fiscal Year Research-status Report
ストレス感受性転写因子NPAS4の機能破綻による精神疾患発症機構の解析
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26460095
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
日比 陽子 名古屋大学, 医学部附属病院, 薬剤師 (70295616)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | Neuronal PAS domain 4 / 遺伝子欠損マウス / 精神疾患 / 脳 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
NPAS4は、GABA作動性抑制性神経の発達やシナプス形成との関連が報告される転写因子である。NPAS4がストレスにより発現低下することから、この転写因子がストレス・GABA神経系障害・精神症状発症の関係の鍵であると考えられる。そこで本研究では、NPAS4の発現減少とGABA作動性神経系の機能異常との関連を調べる。これまでに、全身性NPAS4遺伝子欠損 (NPAS-KO) マウス脳内のGABA作動性神経関連分子の発現解析およびNPAS4-KOマウスの精神疾患様行動発現解析をおこない、Npas4-KOマウスが多動、不安関連行動の減少、恐怖記憶の低下、PPIの障害の他、協調運動や運動学習能力の低下を示すことを明らかにした。また、Npas4-KOマウスの脳各部位においてGABA受容体のmRNAレベルが顕著に低下していることを見出した。さらにストレス負荷によるNpas4プロモーターのDNAメチル化亢進についてさらに詳しく解析した。3週間の拘束ストレスはNpas4プロモーターの転写開始点付近のCpGアイランドのDNAメチル化を亢進し、この領域に含まれる2つのCRE配列に部位特異的変異を導入するとNpas4プロモーター活性が低下したことから、これらのCRE配列がNpas4プロモーター活性に重要であり、ストレス負荷が誘発するDNAメチル化亢進がCRE配列を介したNpas4転写を抑制したことが示唆された。平成28年度は、Npas4の発現上昇による精神疾患の治療を目標としてNpas4プロモーターをクローニングしてプロモーターアッセイ系を確立し、Npas4プロモーター活性を誘導する化合物探索をおこなった。市販の活性化合物ライブラリの中から、ヒトNpas4プロモーター活性を上昇させる化合物を見出した。この化合物は濃度依存的にヒトおよびマウスのNpas4プロモーター活性を上昇させた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成28年度の目標は、(1)全身性Npas4-KOマウスのNpas4発現レスキュー実験として、生後1週間のNpas4-KOマウスの脳各部位にNpas4強制発現ウイルスを感染させ、当該部位や投射先の脳部位におけるGABA受容体サブユニットおよびGABA作動性神経関連分子の発現変動、またNMDA受容体の発現変動をmRNAレベルおよび蛋白質レベルで解析する。(2)ストレス負荷によるNPAS4発現低下を抑制するため、野生型マウス脳の各部位にNPAS4強制発現ウイルスを感染させたのち、ストレス負荷による精神疾患様行動の発現やGABA受容体およびNMDA受容体の発現変動を調べる。(3) Npas4-floxマウスとCreウイルスを用いたNpas4の部位特異的欠失により発現する精神疾患様行動を解析すると同時にGABA受容体およびNMDA受容体の発現変動を確認する、であった。部位特異的Npas4-KOマウスについてはCreを発現するウイルスをNpas4 floxマウスに注入し、部位特異的なNpas4発現消失を検出する系を構築中であるが難航している。NPAS4強制発現ウイルスプラスミドについてもin vivoにて発現を確認するまでにまだ時間を要する。一方で、脳の発生やシナプス調節に重要な役割を持つ因子がNPAS4のターゲット遺伝子として可能性があることを見出したので解析の準備を進行している。また、NPAS4を鍵とした精神疾患治療開発のため、ストレスによるNPAS4の発現低下による脳神経機能の異常を、NPAS4発現誘導により改善する可能性を期待しNpas4プロモーター活性化経路およびNpas4発現誘導化合物の探索を試みるプロモーターアッセイ系を構築し、市販の化合物ライブラリから候補化合物を探索している。現在までに数種類の候補化合物を見出している。
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| Strategy for Future Research Activity |
NPAS4の発現低下による脳神経機能異常発現が示されたので、NPAS4発現誘導による神経機能異常の改善を期待し、Npas4プロモーター活性を上昇させる化合物の探索も行う。
(1)全身性Npas4-KOマウスの小脳切片をプルキンエ細胞マーカーであるcalbindinやparvalbuminで染色し形態を解析する。また、脳の発生やシナプス調節に重要な役割を持ち、小脳での役割も大きい因子の発現との関連も調べる。さらに、Npas4-KOマウスのストレス応答性について調べる。
(2)ヒトNpas4プロモーターを組み込んだアッセイ系を用いて、Npas4発現増大を誘導する化合物を探索する。見出されたヒトNpas4プロモーター活性化化合物がマウスNpas4プロモーターにも有効であることを確認し、作用機序を分子生物学的解析により明らかにする。
(3)Npas4-floxマウスの脳各部位にCreウイルスを感染させることで部位特異的Npas4-KOマウスを作製する系を完成する。そして、Npas4の部位特異的欠失により発現する精神疾患様行動を解析する。また、それぞれの部位のGABA受容体およびNMDA受容体の発現変動を確認する。
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| Causes of Carryover |
平成27年度からの残分があったことと、部位特異的Npas4遺伝子欠損マウスの構築に時間を要しているため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
・Npas4のプロモーターアッセイを行うための遺伝子導入試薬、プレートおよびアッセイ用試薬を購入する。・クローニングや変異導入のためのオリゴヌクレオチド、制限酵素、DNA精製キットを購入する。・in vitroにおける免疫組織学的解析のための各種試薬を購入する。・mRNA変動を検出するための、RNA精製用のキット、逆転写酵素、リアルタイムPCR用キットを購入する。また、生化学的解析に用いる各種抗体を購入する。・生体内におけるNPAS4プロモーターのDNAメチル化変動や遺伝子多型を調べるための、ゲノムDNA精製キットやPyroMarkシステム用解析試薬やプレート、オリゴヌクレオチドを購入する。・本研究で得られた成果の公表のため論文投稿費に使用する。
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Research Products
(1 results)
