2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒト肺癌におけるAkt/mTORと周辺遺伝子群の解析と個別化治療への展開
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26460438
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
土橋 洋 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90231456)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉 自治医科大学, 医学部, 准教授 (50406055)
後藤 明輝 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90317090)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 肺癌 / Akt / 遺伝子増幅 / microRNA / MLPA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肺癌において、増殖シグナルエフェクター蛋白質であるAktを中心とした系の異常、活性化制御を解析している。2015年度は,
1. CytoSNPチップを用いた多型解析で、AKT1-rs2498794の T-alleleは短期間喫煙歴群(44年未満), 少量喫煙群(<20本/日)で有意に癌罹患性が低い事を見出した。
2. AKT1、AKT2遺伝子のみの増加群で変動するmicroRNA(miR)を2000種搭載Human miRNA arrayで解析した。両群間で発現に2倍以上の差があり、かつAKT遺伝子増加の無い群よりも発現の高いmiRを112種同定した。その中で、i)特に癌の増殖、浸潤、転移等に関わるmiR-200aは腺癌、早期の癌(Stage-I,II)ではAKT1により亢進する、ii)しかしそのターゲットのZEB1の亢進は惹起しない, iii)miR-200a,b,cともリンパ管侵襲とは負の相関を示すが、血管侵襲とは相関しない事、等を明らかにした。
3. 約100症例 (全組織型) で細胞周期制御因子p27と3種ubiquitin ligaseの発現の関連を免疫染色で検索した。その結果、Skp2は扁平上皮癌、小細胞癌で発現頻度が高く、Pirh2, KPCは非小細胞癌で高頻度であった。臨床病理学的にKPC発現はT因子、細胞質p27はN因子、Pirh2はpStageと有意な相関を示し、組織型特異的なp27制御機構と、ligaseの悪性度の規定因子としての有用性が示された。
4. MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法に使用するAKT1, AKT2のカスタムプローブを独自にデザイン、合成し、遺伝子数を定量解析した結果、AKT1, AKT2遺伝子ともに、FISH解析では同定できなかった微細な遺伝子増加を約25％の症例で確認した。これらでは必ずしもAkt蛋白の活性化を伴っていないため、遺伝子不安定性との関連を解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 遺伝子多型解析では従来報告の無かったAKT1-rs2498794の臨床病理学的意義を初めて明らかにし、同時にAKT3の候補多型部位に関する解析では有意なデータは無く、AKTの多型解析は終了とした。 2. AKT1、AKT2遺伝子関連miRに関しては、miR-200との関わりを明らかにはしたが、包括的解析としては他のターゲット、他のmiRに関する知見にはややしい。
上記1,2は、研究会、学会(2015年日本病理学会、日本癌学会総会)、英文誌上(Hum. Path. I press.)報告で発表済みである。
3. MLPA法による解析ではカスタムプローブのデザイン、合成が予想以上の好結果につながり、多数症例においてAKT遺伝子の微細な増加を検出できたので、その意義の検討のため、横浜私立医大と共同研究を開始する。 4. Akt/mTORの増加に伴って変動する遺伝子、蛋白質の解析は、mRNA, miRNAの両方のmicroarray解析が終了し、候補を絞り込んで培養細胞系での解析を開始している。 5. p27とその3種ubiquitin ligaseの発現の関連に関しては免疫染色で興味深いデータが得られ, 2016年日本病理学会発表、論文準備中である。培養細胞系での解析の方向性を共同研究者の浜松医大・北川らと検討中である。
以上、共同研究者(秋田大学・浜松医大)、研究協力者(金沢大)との連携、当施設での試料収集と臨床病理学的解析も順調で、研究グループの密な協力関係のもとに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. AKT1、AKT2遺伝子関連microRNA(miR)に関しては、今回明らかにしたmir-200 familyのZEB1以外のターゲット、また他のmiRを解析すべく共同研究者(秋田大学)と解析中である。
2. MLPA解析は39例の既存のgenomic DNAを使用したが、今後さらに症例を追加し、vaalidation studyを行う。また遺伝子不安定性との関連を、Lynch症候群で報告されている5か所と4回繰り返し箇所10か所を標的としてPCRで解析予定であるが、この分野の専門家である横浜私立医大・病理学講座と共同研究する。現在、そのための追加倫理申請の準備中である。
3. mRNA arrayで抽出したAkt/mTORに伴って変動する蛋白質の解析は、その候補蛋白を専門に解析している東大医学部・消化器外科にコンサルとして、患者血清と培養細胞の両面からの解析を検討中である。
4. p27とubiquitin ligaseの関連の解析に関しては、ligaseの遺伝子変化の解析もMLPA法で解析する予定であり、金沢大学、浜松医大と共同研究予定であるが、AKT遺伝子のMLPA解析に成功した方法と同様のプロトコールでカスタムプローブをデザイン中である。
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| Causes of Carryover |
1. MLPA解析のカスタムプローブ作製、その後の解析に難渋することが予想されたが、初回作製の1種類のプローブで実験に成功し、有料ではあるが業者に迅速で安価な受託解析を依頼できたため、経費が節約できた。また、遺伝子多型、microRNA, MLPA, ubiquitin ligaseの解析等、他施設, あるいは当施設他科との共同研究が多く、経費の支出に関する相談の結果、先方の支出により消耗品を購入できた部分が多々あった。また、試薬、特にkit等の購入に際し、業者のキャンペーン期間中に安価に購入できた試薬が多かった。
2. 投稿論文が採択されたが、出版が来年度になったため、掲載料(カラー写真費用も含む)、別刷経費の支払いが来年度となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
1. 上記の採択論文に関わる諸経費を支出する。
2. 培養細胞を利用した基礎実験を計画しているので、そこに重点的に繰越金を投入する。また、繰越金を利用して、microRNA解析で当初は予定していなかった、miR-200以外のmiRのvalidation studyや機能解析を行う。
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[Journal Article] Semi-comprehensive analysis of gene amplification in gastric cancers using multiplex ligation-dependent probe amplification and fluorescence in situ hybridization.2015
Author(s)
Ooi, A., Oyama, T., Nakamura, R., Tajiri, R., Ikeda, H., Fushida, S., Nakamura, H., Dobashi, Y.
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Journal Title
Modern Pathology
Volume: 28(6)
Pages: 861-871,
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Diverse involvement of isoforms and gene aberrations of Akt in human lung carcinomas.2015
Author(s)
Dobashi, Y., Tsubochi, H., Matsubara, H., Inoue, J., Inazawa, J., Endo, S., Ooi, A.
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Journal Title
Cancer Science
Volume: 106(6):
Pages: 772-781
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Association between AKT1 gene polymorphism rs2498794 and smoking-related traits with reference to cancer susceptibility2015
Author(s)
Nishizawa, D., Kasai, S., Hasegawa, J., Sato，N., Tanioka, F., Sugimura, H., Ikeda, K. and Dobashi, Y.
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Journal Title
Biomedical Research. International;
Volume: 2015.94.
Pages: 1-12,
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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