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2016 Fiscal Year Research-status Report

ヒト肺癌におけるAkt/mTORと周辺遺伝子群の解析と個別化治療への展開

Research Project

Project/Area Number 26460438
Research InstitutionJichi Medical University

Principal Investigator

土橋 洋  自治医科大学, 医学部, 准教授 (90231456)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 北川 雅敏  浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉  自治医科大学, 医学部, 准教授 (50406055)
後藤 明輝  秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90317090)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2018-03-31
Keywords肺癌 / Akt / ubiquitin ligase / microRNA / p27 / Pirh2 / MLPA
Outline of Annual Research Achievements

肺癌において、増殖シグナルエフェクター蛋白質であるAktを中心とした系の異常、活性化制御を解析した。
1. AKT1、AKT2遺伝子のみの増加群で変動するmicroRNA(miR)をmiR arrayでscreeningし、i) miR-200aは腺癌、早期の癌(Stage-I,II)ではAKT2により亢進する、ii) miR-200a,b,cともリンパ管侵襲とは負の相関を示すが、血管侵襲とは相関しない事、等を明らかにした。更に、200aのターゲットのZEB-1, PTEN, YAP-1, EphA2, b-catenin, E-cadherin の染色スコアを解析した結果、腺癌、Stage I+II群ではEphA2の発現がAKT2増幅群で有意に低かった。かつEphA2スコアとmiR200aは逆相関を示し、AKT2→miR200aの系でEphA2の関与が示唆された。
2. 93症例 (全組織型) で細胞周期制御因子p27と3種ubiquitin ligaseの発現の関連を免疫染色で検索した。Skp2は扁平上皮癌、小細胞癌で、Pirh2, KPCは非小細胞癌で発現が高頻度だった。臨床病理学的に腺癌でKPC発現はT因子、Pirh2はpN, pStageと、扁平上皮癌で細胞質p27はN因子と有意な相関を示した。また、Pirh2は腺癌では予後とも相関し、組織型特異的なp27制御機構と、ligaseの悪性度の規定因子としての有用性が示された。
3. MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法のAKT1, AKT2のカスタムプローブを独自に合成し、遺伝子数を定量解析した結果、FISH解析で同定できなかった微細な遺伝子増加を約25%の症例で確認した。しかし、この遺伝子数の増加は遺伝子不安定性とは関連を認めなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1. AKT1、AKT2周辺因子としてmiR-200aの肺癌における関与を示したが、その下流因子として多数の候補蛋白質の中からEph2の関与も示した。2017年日本病理学会と英文誌上(Hum. Path. 1996)で報告済みである。
2. MLPA解析ではカスタムプローブのデザインが予想以上の好結果につながり、多数症例においてAKT遺伝子の微細な増加を検出できた。しかし横浜私立医大との共同研究の結果、当初予想した遺伝子不安定性との関連は見いだせなかった。
3. Akt/mTORの増加に伴って変動する遺伝子、蛋白質の解析は、mRNA, miRNAの両方のmicroarray解析が終了し、候補を1蛋白質に絞り込んだ。このmTOR下流蛋白質を専門に解析している東大・消化器外科と共同で、患者血清と培養細胞の両面からのELISA解析を行っている。また、肺癌組織切片での免疫染色を開始した。 培養細胞系での解析を進めるべく全ての組織型の現有肺癌細胞株を培養, かつATCCから購入予定である。それら多種細胞でm市販のTOR阻害剤を用いた解析を計画している。
4. p27とそのubiquitin ligaseの発現の関連に関しては2016年日本病理学会発表し、論文報告も終了した(Hum. Path. In press)。培養細胞系での解析を開始した。
以上、共同研究者(秋田大学・浜松医大)、研究協力者(金沢大)との連携、当施設の坪地による試料収集と臨床病理学的解析も順調で、研究グループの協力で順調に進行した。

Strategy for Future Research Activity

1. AKT1、AKT2関連miR(miR-200a)のターゲットとしてのEphA2について、培養細胞でAKT2を高発現、ノックアウトし、validationを行う。また他のmiRを共同研究者(秋田大学・後藤)と解析中である。
2. mRNA arrayで抽出したAkt/mTORに伴って変動する蛋白質の解析は、その候補蛋白を専門に解析している東大・消化器外科と共同で、患者血清と培養細胞の両面からのELISA解析と組織切片上での免疫染色を平行して継続する。また、mTORとの関連性を確認するために培養細胞にrapamycin誘導体を投与し(市販のeverolimusを購入)動態変化をvalidationする。この際のwesternの系はmTORでは確立済みである(Cancer, 2009年)。また、promoterをluciferase vector (pGL4.10)に人工合成で組み込み,コントロールのpGL4.54 vectorと比較して luciferaseの発現がrapamycinで抑制されることを確認する。
3. p27とubiquitin ligaseの解析は, 培養細胞でPirh2を高発現、ノックアウトし、形質変化を検索する実験を浜松医科大学・北川と計画中である。ligaseの遺伝子変化もMLPA法で金沢大学、浜松医大と共同で解析するため、AKTのMLPAに成功したプロトコールでカスタムプローブをデザイン中である。

Causes of Carryover

1. 培養細胞での基礎実験の予備実験に使用したい。
2. 投稿論文が最近採択されたので、論文関連諸経費の支払いも2017年度となった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

1. 上記の培養細胞での基礎実験に繰越金を使用する。
2. 上記の採択論文に関わる掲載料(カラー写真費用も含む)、別刷経費を支出する。

  • Research Products

    (10 results)

All 2017 2016

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results,  Acknowledgement Compliant: 4 results,  Open Access: 1 results) Presentation (5 results)

  • [Journal Article] Loss of YAP1 Defines Neuroendocrine Differentiation of Lung Tumors2017

    • Author(s)
      Ito T, Matsubara D, Tanaka I, Makiya K, Tanei Z, Kumagai Y, Shiu SJ, Nakaoka H, Ishikawa S, Isagawa T, Morikawa T, Shinozaki A, Goto Y, Nakano T, Tsuchiya T, Tsubochi H, Komura D, Aburatani H, Dobashi Y, Nakajima J, Endo S, Fukayama M, Sekido Y, Niki T and Murakami Y
    • Journal Title

      Can Sci

      Volume: 107 Pages: 1527-38,

    • DOI

      10.1111/cas.13013

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Gene amplification of CCNE1, CCND1 and CDK6 in gastric cancers detected by multiplex ligation-dependent probe amplification and fluorescence in situ hybridization.2017

    • Author(s)
      Ooi, A., Oyama, T., Nakamura, R., Ikeda, H., Fushida, S. and Dobashi, Y.
    • Journal Title

      Hum Pathol.

      Volume: 61 Pages: 58-67

    • DOI

      10.1016/j.humpath.2016.10.025

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Regulation of p27 by ubiquitin ligases and its pathological significance in human lung carcinomas.2017

    • Author(s)
      Dobashi. Y., Tsubochi, H. Minegishi, K., Kitagawa, M., Otani, S. and Ooi, A.
    • Journal Title

      Hum Pathol.

      Volume: 印刷中 Pages: 印刷中

    • DOI

      -

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] MicroRNAs associated with increased AKT gene number in human lung carcinoma2016

    • Author(s)
      Goto. A., Dobashi. Y., Tsubochi, H. and Ooi, A.
    • Journal Title

      Hum Pathol.

      Volume: 56 Pages: 1-10

    • DOI

      10.1016/j.humpath.2016.04.011.

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] A case of severe uterine bleeding postpartum following manual removal of placenta increta.2016

    • Author(s)
      Chikazawa, K., Akashi, K., Gomi, Y., Tachibana, K., Horiuchi, I., Dobashi, Y., Okochi, T., Hamamoto, K., Tanno, K. and Takagi K.
    • Journal Title

      Taiwan J Obst. Gynecol.

      Volume: 55 Pages: 913-4.

    • DOI

      10.1016/j.tjog.2015.09.008.

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] MLPA とFISH を用いた乳癌における遺伝子増幅の準網羅的検索2017

    • Author(s)
      大井 章史、中村 律子、尾山 武、池田 博子、土橋 洋
    • Organizer
      第106回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2017-04-28
  • [Presentation] 肺癌でAKT 遺伝子増幅に伴い変動するmicroRNA とそのターゲット2017

    • Author(s)
      土橋 洋、後藤 明輝、松原 大祐、椙村 春彦、大井 章史
    • Organizer
      第106回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2017-04-27
  • [Presentation] Gene amplification of CCNDE1, CCND1 and CDK6 in gastric cancers detected by MLPA and FISH.2016

    • Author(s)
      大井 章史、尾山 武、中村 律子、土橋 洋
    • Organizer
      第75回日本癌学会総会
    • Place of Presentation
      横浜
    • Year and Date
      2016-10-06
  • [Presentation] 胃癌におけるサイクリンE, D1, CDK6増幅のMLPAおよびFISHによる検索.2016

    • Author(s)
      大井 章史、田尻 亮輔、中村 律子、尾山 武、池田 博子、土橋 洋.
    • Organizer
      第105回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-05-14
  • [Presentation] ヒト肺癌における細胞周期抑制因子p27の3種ubiquitin ligaseによる制御.2016

    • Author(s)
      土橋 洋、後藤 明輝、山田 茂樹、大井 章史.
    • Organizer
      第105回日本病理学会総会
    • Place of Presentation
      仙台
    • Year and Date
      2016-05-12

URL: 

Published: 2018-01-16  

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