2015 Fiscal Year Research-status Report
樹立した微乳頭肺腺癌細胞株を用いた種々の腫瘍特異的マーカー獲得戦略
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26460441
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
佐藤 雄一 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (30178793)
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2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 微乳頭肺腺癌 / 樹立細胞株 / 山中4因子 / 癌iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は世界で初めて微乳頭構造を有する肺腺癌(micropapillary pattern adenocarcinoma of the lung)細胞株を樹立しKU-MPPAC細胞と命名した。この細胞株を用いてMPPACを規定するバイオマーカーの探索を行うことを研究の目的としている。今年度は作製したMPPAC細胞を用いた癌iPS細胞の作製を行った。方法は、KU-MPPAC細胞に山中4因子（KLF-3, c-MYC, OCT3/4, SOX2）の導入されたそれぞれのウイルスベクターが混合されている溶液を加え培養する方法で癌幹細胞の樹立を行った。樹立した細胞をH-SFM培地とコラーゲンIVコーティングディッシュで培養すると接着細胞として、EB培地とLow-attachment 24-well plateで培養するとEB様細胞塊の形態を取る。作製した細胞はKU-MPPAC4Fとした。この細胞は免疫ブロット法で導入した4つの因子の発現があることを確認している。樹立した細胞をSCIDマウスに移植したところ、親株であるKU-MPPAC細胞と同様の形態を示していたが、免疫染色の結果iPS細胞の特徴であるSOX2, OCT3/4, KLF4, c-MYCの発現が亢進していた。その他、Nestin, ABCG2, PDPN, CD47ALDH1A1, TROYなど幹細胞のマーカーとして報告されている分子の発現亢進も確認した。さらに、KU-MPPAC染色体解析を行い、1番2番10番22番染色体のトリソミーや様々な染色体異常があり、モダル数として48本であることが分かった。肺腺癌細胞株であるA549とKU-MPPAC細胞でのmRNA発現のプロファイルを行い、KU-MPPAC細胞は神経内分泌細胞由来の分子の発現が上昇していることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
治療抵抗性の原因の一つは、腫瘍内に存在する癌幹細胞の存在と言われている。しかし、通常その存在量は少ないことから、それら細胞の詳細な解析が出来ていないことが挙げられる。MPPAC細胞に存在する癌幹細胞を豊富にしてそれら細胞の特徴を明らかにする目的でKU-MPPAC細胞のiPSを考えた。今年度の目的は、KU-MPPAC細胞を用いて癌iPS細胞化を行うための基礎的方法の確立を行い、癌iPS細胞を樹立することを第一の目的とした。その結果、様々な条件を振りながら、最終的に癌iPS細胞の樹立をすることが出来た。樹立した細胞はKU-MPPAC4Fと命名した。この細胞は、導入した山中4因子の発現が亢進しており、これまでに様々なiPS細胞で報告のある分子の発現が亢進していた。この細胞は親株であるKU-MPPAC細胞と同様の分子の発現が認められると同時に各種幹細胞マーカーの発現が亢進していた。また、KU-MPPAC, KU-MPPAC4F細胞をSCIDマウスの皮下に移植することで、移植腫瘍を作製することも出来た。形態的には両者とも同様で、外科組織中のMPP様形態を示していたが、幹細胞マーカーの発現は異なっていた。両者の細胞をmRNA解析、プロテオーム解析などを駆使し、両者の発現プロファイリング、特にその癌幹細胞で発現している分子の同定を今後していく予定である。
微乳頭肺腺癌細胞株KU-MPPAC細胞を用いた各種プロテオーム解析法を駆使した腫瘍特異的マーカー候補タンパク質の解析や染色体解析、mRNAの発現解析は修了している。しかし、これらマーカー候補タンパク質の更なる解析は今年度出来なかった。来年度に行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
高悪性である微乳頭肺腺癌の新たなマーカー候補タンパク質、特に治療抵抗性である癌幹細胞のマーカーを獲得するためにKU-MPPACとKU-MPPAC4F細胞を用いて以下の実験を行う。１．両者の高分子量タンパク質、低分子量タンパク質、分泌タンパク質の二次元電気泳動法を用いた解析を行い、特に後者で発現に亢進のある分子の同定を進める。２．両者のmRNA 発現解析をcDNAマイクロアレイ法で行う。３．KU-MPPAC4F細胞を免疫源に単クローン性抗体を作製し、免疫組織化学的スクリーニングでKU-MPPAC4F細胞で陽性、KU-MPPAC細胞で陰性のクローンを抽出し、抗体の樹立を行う。
KU-MPPAC細胞の各種プロテオーム解析、mRNA解析で共通して認められる分子について、自裁のMPPAC症例を用いて、その特異的発現の有無を検討する。
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| Causes of Carryover |
昨年度は、ほぼ計画的に研究費を使用した。しかし、一昨年度の使用額が少なかった結果、次年度の使用額に変更が生じてしまっている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は、樹立した微乳頭肺腺癌細胞株KU-MPPAC細胞と、これをiPS化した癌細胞KU-MPPAC4Fにおけるタンパク質やmRNA発現の相違、特にiPS化した細胞における発現を中心に、新たな治療標的となり得るマーカー候補分子の獲得を目指すため、研究費のほとんどを消耗品の購入に充てる予定である。その他、成果発表学会出張費として100,000円、外国語論文の校閲料として100,000円を計上している。
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Research Products
(15 results)
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[Journal Article] Serum anti-Gal-3 autoantibody is a predictive marker of the efficacy of platinum-based chemotherapy against pulmonary adenocarcinoma.2015
Author(s)
Yanagita K, Nagashio R, Ryuge S, Katono K, Jiang S-X, Tsuchiya B, Nakashima H, Fukuda E, Goshima N, Saegusa M, Satoh Y, Masuda N, Sato Y.
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Journal Title
Asian Pac J Cancer Prev
Volume: 16 (17)
Pages: 7959-7965
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] S100A16 is a prognostic marker for lung adenocarcinomas.2015
Author(s)
Saito K, Kobayashi M, Nagashio R, Ryuge S, Katono K, Nakashima H, Tsuchiya B, Jiang S-X, Saegusa M, Satoh Y, Masuda N, Sato Y.
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Journal Title
Asian Pac J Cancer Prev
Volume: 16(16)
Pages: 7039-7044
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Calnexin is a novel sero-diagnostic marker for lung cancer.2015
Author(s)
Kobayashi M, Nagashio R, Jiang S-X, Saito K, Tsuchiya B, Ryuge S, Katono K, Nakashima H, Fukuda E, Goshima N, Satoh Y, Masuda N, Saegusa M, Sato Y.
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Journal Title
Lung Cancer
Volume: 90
Pages: 342-345
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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