2014 Fiscal Year Research-status Report
敗血症の病態形成における好中球NETsと危険信号分子alarminの役割
| Project/Area Number |
26460538
|
|---|
| Research Institution | Juntendo University |
|---|
Principal Investigator |
長岡 功 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60164399)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
桑原 京子 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10167976)
射場 敏明 順天堂大学, 医学部, 教授 (40193635)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | NETs / 敗血症 / 細胞死 / リポ多糖 / 好中球 / alarmin / サイトカイン / 感染防御・制御 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
敗血症では過度の炎症反応や宿主細胞の細胞死が病態に関わっている。そして近年、好中球が自らのDNAを網目状構造物NETs (neutrophil extracellular traps)として細胞外に放出し、病原細菌を捕獲・殺菌することが見出された。しかし、NETsは宿主細胞の活性化や細胞死に関わる、内因性の危険信号分子alarminを含むことから、NETsが殺菌作用だけでなく、宿主細胞の活性化や細胞死を介して敗血症の病態に関わることが予想される。そこで、本研究では、好中球のNETsとalarminに焦点を当てて敗血症の病態を解明する。
好中球NETsの宿主細胞に対する活性化・ 障害作用の解析（in vitroでの研究）
方法：マウスの骨髄細胞から分離した好中球をリポ多糖（LPS）で刺激してNETsを放出しNTEsを回収した。回収したNETsを、マウスマクロファージ系細胞J774に作用させ、細胞を活性化あるいは障害するかをサイトカイン生成と細胞障害性（LDH放出）を指標にして評価した。
結果と考察：NETsとして回収した成分には、好中球の顆粒タンパク質であるミエロペルオキシダーゼとDNAの複合体が含まれていたことから、この成分にNETsが含まれていることが確認された。NETsをJ774細胞に作用するとIL-1βが放出された。しかし、LDHの放出は誘導されず、細胞死をともなわないことがわかった。さらに、NETsによるIL-1β放出は、J774細胞をカスパーゼ-1、カスパーゼ-8、さらにセリンプロテアーゼの阻害剤で処理すると抑制された。また、NETsをDNA分解酵素で処理するとIL-1βの放出が減弱した。
以上の結果から、NETsはマクロファージ系細胞を刺激してIL-1βを放出するが、その作用には、NETsのDNA成分、細胞内のカスパーゼ、セリンプロテアーゼ等が関与することがわかった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「研究実績の概要」の述べたように、in vitroでの好中球NETsの宿主細胞に対する活性化・ 障害作用の解析については一定の成果を得ている。しかし、当初、予定されていた、「敗血症モデルを用いた評価」と「敗血症例を用いた評価」については研究が遅れている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１．敗血症モデルを用いた評価
ICR系マウスの盲腸を結紮し、注射針で穿孔すると腸管から菌が腹腔に漏出して、敗血症を誘発する（盲腸結紮穿孔モデル）。また、マウスの気道に大腸菌あるいはリポ多糖（LPS）を投与して急性肺障害モデルを作成する。これらの動物モデルを用いて、末梢血ならびに腹腔、気道上皮、脾臓などの組織における好中球のNETs形成を、DNA/ヒストン/顆粒タンパク質の三重染色（J Int Med Res 41: 162, 2013）によって評価する。また、NETs形成を、DNA/ヒストン複合体であるヌクレオソームをELISAで定量することによって評価する。
２．敗血症例を用いた評価
敗血症例を用いて、末梢血と採取可能な組織におけるNETs形成を上記の１の方法で評価する。
|
| Causes of Carryover |
実施状況報告書において述べたように、in vitroでの「好中球NETsの宿主細胞に対する活性化・ 障害作用の解析」についての研究は概ね予定通り進められたが、「敗血症モデルを用いた評価」および「敗血症例を用いた評価」についての研究に遅れを生じたために、当該年度の支出額が予定よりも少なく、その結果、次年度使用額が「0」以上になった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は、以下の計画について研究を行い、研究経費を使用する予定である。（１）敗血症モデルを用いた評価：ICR系マウスの盲腸を結紮し、注射針で穿孔すると腸管から菌が腹腔に漏出して、敗血症を誘発する（盲腸結紮穿孔モデル）。また、マウスの気道に大腸菌あるいはリポ多糖（LPS）を投与して急性肺障害モデルを作成する。これらの動物モデルを用いて、末梢血ならびに腹腔、気道上皮、脾臓などの組織における好中球のNETs形成を、DNA/ヒストン/顆粒タンパク質の三重染色（J Int Med Res 41: 162, 2013）によって評価する。また、NETs形成を、DNA/ヒストン複合体であるヌクレオソームをELISAで定量することによって評価する。（２）敗血症例を用いた評価：敗血症例を用いて、末梢血と採取可能な組織におけるNETs形成を上記の１の方法で評価する。
|
