活性化血小板マイクロパーティクル特異的高感度定量法の開発と血栓形成促進作用の解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460679
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 岡野 こずえ 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50160693)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野島 順三 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30448071) ; 丸田 雄一 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 学術研究員 (30543970)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: aPLT-MP / ELISA法 / サンドイッチ法 / 血小板関連抗体 / ペルオキシダーゼ標識抗マウス・ウサギ抗体 / ドットブロット法・免疫染色法

Outline of Annual Research Achievements

１．活性化血小板由来マイクロパーティクル（aPLT -MP）の作製:学生ボランティアからクエン酸Na抗凝固剤加静脈血を採取し、血小板富裕血漿（Platelet Rich Plasma）を作製する。PRPにADP、コラーゲン、トロンビン等の刺激物質を加え血小板を活性化させて凝集塊およびaPLT-MPを産生する。
２．ELISA法によるaPLT -MPの測定法の開発:検出ELISA法は、96 Wellマイクロプレートを用いて2種類の抗体のサンドイッチ法で検出する。使用するモノクローナル抗体は、市販品を使用する。
２-（１）aPLT-MP測定用ELISAに使用した抗体:血小板関連抗体：抗フォンビルブランド（vWF）抗体（DAKO社），抗CD36抗体（IMMUNOTECH社），抗CD41抗体（NICHIREI CORPORATION社）, 抗CD42b抗体（BioRegend社）, 抗CD61抗体（Santa Cruz Biotechnology社）,抗 GP1b抗体（DAKOPATTS社），抗CD62P抗体（Bioscience社），抗p53抗体（DAKO社），抗CD40抗体（CALTAG LABORATORIES社），抗ヒトフィブリノゲン(Fib)抗体(American Research Products社)，抗アネキシン-V抗体（Miltenyi Biotec社）を選んだ。
２-（２）aPLT-MPに感度・特異性の高い抗体の選択:１．で作製したaPLT-MPを使って、２-（１）の抗体の中からaPLT-MPに最も感度・特異性の高い抗体をセルロースアセテート膜(セ・ア膜)(PROTRAN Nitrocellulose Transfer Membrane：Schleicher & Schuell社)とペルオキシダーゼ標識抗マウス・ウサギ抗体（ヒストファインシンプルステインMAX-PO，株式会社ニチレイバイオサイエンス）を用いたドットブロット法・免疫染色法で選んだ。
２-（３）２-（２）の結果から96 Wellマイクロプレートを用いたサンドイッチ法に適したキャプチャー抗体とヂィテクター抗体の組み合わせを検討中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ELISA法のサンドイッチ法に使用する血小板関連抗体の種類が多いため、感度・特異更に定量性の高い抗体の選択に手間取っている状況であるが、キャプチャー抗体に抗フォンビルブランド（vWF）ポリクロナール抗体、ヂィテクター抗体に抗アネキシン-V、抗 GP1b、抗CD36の各モノクロナール抗体で血小板由来マイクロパーティクルに特異性が見られる結果が得られている。
更に定量性の高い結果を得るために反応条件を検索中であり、おおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

血小板に対する感度・特異性、更に定量性の高い抗体の選択ができれば、各種患者検体中の血小板由来マイクロパーティクル量をELISA法で測定できる。更に、血小板以外の血管内皮細胞由来や単球由来のマイクロパーティクル測定法を開発して、心臓疾患や脳血管系疾患などの病態の評価が出来る検査法になると考えられる。