活性化血小板マイクロパーティクル特異的高感度定量法の開発と血栓形成促進作用の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460679
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 岡野 こずえ 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50160693)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野島 順三 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30448071) ; 丸田 雄一 山口大学, 医学部, 特別医学研究員 (30543970)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: aPLT-MP / ELISA法 / 血小板関連抗体 / 赤血球 / 好中球 / 単球 / 血管内皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

１、活性化血小板由来マイクロパーティクル（aPLT-MP）の作製：学生ボランティアから採取したクエン酸Na抗凝固剤加静脈血を用いて作製した多血小板血漿をADP刺激および破砕操作でaPLT-MPを作製した。
２、aPLT-MPの測定法の開発：作製したaPLT-MPを対象とし、特異的で高感度に測定できるELISA法の条件を検討した。①血小板関連：抗CD36モノクローナル抗体(Mb)、抗 GPIb Mb、抗p53 Mb、抗CD40 Mb、抗AnnexinV Mb、抗TP80 Mb、抗vWFポリクローナル抗体(Pb)、抗AnnexinV Pb、抗GPⅡb/Ⅲa Pbを固相化用と検出用に組み合わせた。②ペルオキシダーゼ標識抗体：抗マウス・ウサギ抗体、抗マウス抗体で抗原抗体産物を標識した。③ブロッキング液（0.5%スキムミルク）、洗浄液（PBS）でブロッキングと洗浄を行った。④発色試薬：TMB、発色停止液（1N塩酸）で発色させ420nmで吸光度を求めた。
３、結果：１）血小板関連抗体の選択：感度は、固相化用に1,000倍希釈の抗Annexin-V Pb、検出用に1,000倍希釈の抗GPIb Mbが最適な組み合わせであった。２）反応条件：検体反応は37℃で4時間、抗体反応は37℃で1時間が最適であった。３）特異性：開発したaPLT-MP検出用ELISA法を使って血小板や赤血球、好中球、単核球由来MPとの反応性を比較し、aPLT-MPにのみと反応性を示した。４）検体保存：凍結が最適であった。５）再現性：CVが12.6％で良好であった。
４、考察：開発したELISA法で健常人の静脈血aPLT-MPを測定したところ、採血針、採血管、採血の方法等の違いが測定値に有意に影響するため、厳密な採血条件の統一が必要であると考えられた。今後は、採血条件を統一化した後に各種疾患のaPLT-MP値を測定し、疾患との関連を追究したい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

感度・特異性の高いaPLT-MP検出ELISA法の測定条件が決まった。しかし、採血針、採血管、採血の方法等の違いが測定値に有意に影響するため、厳密な採血および測定条件について検討中である。

Strategy for Future Research Activity

感度・特異性、更に定量性の高いaPLT-MP検出ELISA法の測定法が決まれば、健常人や各種疾患患者検体中のaPLT-MP量の測定を行う。それら結果と疾患との関連性を検索し、臨床検査法としてのaPLT-MP量検査法の有用性が評価出来ると考えられる。

Causes of Carryover

研究分担者2名（野島順三、丸田雄一）が、平成27年度の試薬購入費が低額で済んだり、旅費に使用しなかっため、予算が残った。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究分担者2名（野島順三、丸田雄一）および岡野こずえが、平成28年度に必要な試薬の購入や旅費で使用する予定である。